cDNA第一链合成试剂盒.doc

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cDNA第一链合成试剂盒
操作方法
1、逆转录反应
(1) 在无菌薄壁管中加入以下成份：
Total RNA - ⑥
(dN)9 or oligo(dT) 18 100pmol
(2) 混匀后，70C变性5min,将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以
下成份：
5X M-MLV Buffer 4J
dNTPs( 10mM each 1d
RNasi n 10U
100mM DTT 2J
M-MLV Reverse Tran scriptase 100U
DEPC-treated water up to 20 d
(3) 混匀后短暂离心，使用 oligo(dT)偲引物时在42C，使用随机引物(dN)9 时在37C下温育1小时。
(4) 94 °C 5min终止反应后，冰上冷却。
(5) 合成的cDNA第一链可直接用于PCR扩增或进行其它下游操作。
2、PCRT 增
(1) 在PCR薄壁管中加入以下试剂
Sy nthesized cDNA
10X PCR Buffer
Upper primer
Lower primer
dNTPs (10mM each
Taq DNA Polymerase
ddHO
(2)混匀后短暂离心，然后进行
。进入下列
2-5 d
2d
10pmol
10pmol
d

up to 20 d
PCR扩增。
30~40个循环(此扩增条件仅供参考)：94 C
30s, 60 C 45s , 72 C 1min ~3min。最后 72 C 延伸 7min。
注意事项
1、 确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素， 其纯度及完整性可由OD60/OD28。比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。较纯的 RNA 样品OD60/-，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生
物RNA羊品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1，否则，表明有RNAt解。
2、 避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、试剂和溶液必须完全无菌。操 作过程始终戴手套以杜绝各种 RNA酶的污染。
3、 合成cDNA第一链的引物选择。选择 oligo(dT) 12-18作为反转录弓I物，可保证
cDNA具有完整的3'-端，通常可得到接近全长的 cDNA第一链；若选择随机 寡核苷酸(d