蛋白质纯化实验指导书.doc

1 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书(实验)课程名称: 生物大分子纯化技术电子科技大学教务处制表 2 目录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附:大肠杆菌感受态菌制备( CaCl 2法) 4 质粒提取 5 实验二、 IPTG 诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化 9 实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测 17 3 实验二 IPTG 诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化一、实验目的 ,了解不同表达体系的各自特点; 。二、实验原理卤醇脱卤酶是一类催化短链脂肪族邻卤醇化合物水解的酶,可以将卤醇底物转变为相应的环氧化物和卤离子。而这些被水解的卤素化合物大部分是应用于工业上的碳氢化合物被卤化而形成的环境污染物。因此,卤醇脱卤酶越来越受到研究者的重视。为了进一步研究卤醇脱卤酶的性质,我们将重组的卤醇脱卤酶 HheC 质粒转入大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) 中进行原核表达,经 IPTG 诱导进行重组蛋白体外表达。(一) IPTG 诱导重组卤醇脱卤酶的表达 pGEF 质粒是由 pET 和 pGEM 以及 pBR322 质粒的不同部分拼接得到。其全长约有 4936bp 左右,结构简单,含有一个 Amp 的抗性标记,和 T7 的高表达效率启动子。这种启动子不能被大肠杆菌的 RNA 聚合酶所识别,因此当宿主缺乏 T7RNA 聚合酶时,重组质粒中的外源基因片段是不能表达的。为了使外源基因表达,重组质粒必须转入携带有 T7RNA 聚合酶的宿主大肠杆菌 E. coli BL21 (DE3) 中。这种宿主菌的 RNA 聚合酶基因位于 lacUV5 启动子下游,受其调控。在没有诱导物时,阻遏物与 lacUV5 启动子结合,阻止 RNA 聚合酶转录;在添加了乳糖或乳糖类似物 IPTG 时,阻遏物与诱导物结合,解除了对 lacUV5 启动子的阻遏, RNA 聚合酶得以表达并与 T7 启动子结合,从而启动了外源基因的转录和翻译。这种结构使 pGEFHhes 可以稳定的存在于宿主细胞中, 重组蛋白质在 IPTG 诱导下便可以高效表达。目的蛋白可以通过硫酸铵沉淀和离子交换层析技术与细胞中其他杂蛋白分离开来。(二)离子交换层析将阴离子交换树脂(本身带正电荷) 颗粒填充在层析管内,当带负电荷的蛋白质(pH>pI) 就被吸引,但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同,它们被吸引的程度也不同。然后再用含阴离子(如 Cl -) 的溶液洗柱,含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来, 增加 Cl -浓度,含电荷多的蛋白质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜,同时盐又是强电解质,可抑制蛋白质的解离。因而用高 4 浓度的中性盐,使蛋白质带电量减少,水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白质一般不引起蛋白质变性,故常用于分离各种天然蛋白质。(三)凝胶过滤层析也称为凝胶层析(Gel chromatography) 、排阻层析(eclusion chromatography) 或分子筛层析(molecular sieve chromatography) 。其分离分离机制是按分子大小不同进行分离的一种方法。在分离过程中,小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留,且在凝胶中经过的路程长,因而最后流出;而大分子被排阻在凝胶颗粒外面,在凝胶中经过的路程短,在颗粒之间迅速通过,因而最先出峰。 10 mM Tris/SO 4 buffer (pH ) containing 1 mM ?-mercaptoethanol and 100 mM NaCl. 三、实验仪器和试剂 ,烧杯,试管,恒温摇床,层析柱,超生破碎仪,铁架台,离心机,玻璃棒, 比色杯,分光光度计。 1) LB 液体培养基:酵母提取物 5g ,蛋白胨 10g , NaCl10g 溶于 950ml 双蒸水中,用 10mol/LNaOH 调pH 至7 ,补双蒸水至 1000ml ,高压湿热灭菌 30 分钟,然后 4℃保存备用。 2) LB 固体培养基: 按上述方法配制液体培养基,每 100ml 加入 琼脂粉,高压湿热灭菌 30 分钟,当温度降至 45-50 ℃,无菌操作加入 Amp 至终浓度 100mg/ml 。迅速倒入已灭菌的平皿,制成 Amp 平板。普通平板不加 Amp ,直接倒平板,凝固后用保鲜膜封好, 4℃保存备用。 3) IPTG 溶液: 1g的 IPTG 溶于 10ml 双蒸水中,过滤除菌,分装在 10个 的离心管中。-20 ℃闭光保存备用。 4)抗生素溶液:氨卞青霉素(以下均简写为 Amp )购自 Sigma 公司,以无菌双蒸水配制成 100mg/