微生物的大小及数量的测定.docx

微生物大小及数量测定
试验目标
了解显微镜测定微生物大小和血球计数板测定微生物数量原理。
学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小技术，包含目镜测微尺、镜台测微尺校正技术和测定细胞大小技术。
了解血球计数板结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量技术，包含样品点样、菌数计数方法和计算。
试验原理
1. 微生物大小测定原理
微生物细胞大小，是微生物关键形态特征之一，也是分类判定依据之一。因为菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小工含有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图1）
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中隔板上(此处恰好和物镜放大中间像重合)来测量经显微镜放大后细胞物象。因为不一样目镜、物镜组合放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示长度也不一样，所以目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表相对长度。

图 1 目镜测微尺 图2 镜台测微尺
镜台测微尺（图2）
镜台测微尺是中央部分刻有正确等分线载玻片，通常将lmm等分为100格，每格长l0μm（），是专门用来校正目镜测微尺。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，因为镜台测微尺和细胞标本是处于同一位置，全部要经过物镜和目镜两次放大成象进入视野，即镜台测微尺伴随显微镜总放大倍数放大而放大，所以从镜台测微尺上得到读数就是细胞真实大小，所以用镜台测微尺已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校恰好目镜测微尺在一样放大倍数下测量微生物大小。
2. 血球计数板测定微生物数量原理
镜检计数法适适用于多种含单细胞菌体纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大酵母菌或霉菌泡子可采取血球计数板；通常细菌则采取彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，能够使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。
血球计数板是一块特制厚载玻片，载玻片上有4条槽而组成3个平台。中间平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图3)。每个方格网共分9大格，其中间一大格(又称为计数室)常被用作微生物计数。计数室刻度有两种：一个是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一个是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。不过不管计数室是哪一个结构，它们全部有一个共同特点，即每个大方格全部由400个小方格组成(图4)。
每个大方格边长为1mm，则每一大方格面积为1mm2，每个小方格面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，，所以每个计数室(大方格)，每个小方格体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞数量。

图3 血球计数扳结构
平面图(中间平台分为两半，各半边有一个方格网)
侧面图(中间平