Primer 3 在线引物设计攻略.doc

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Primer 3 在线引物设计攻略
开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：
第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input  ”，网址是/。
第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（如下图）在“Paste source sequence below (5'->3'…”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。
第三步：重要参数设定。首先是“Product Size Ranges ”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是“Primer Tm ”这个和Primer Size差不多。
第四步：Pick primers： 点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还要primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），还要产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。
比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：
WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability
OLIGO                start     len    tm       gc%     any     3'        seq 
LEFT PRIMER       1           33              TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC
RIGHT PRIMER    1388      34               AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT
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