生物化学与分子生物学八年制课件24.ppt.ppt

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第二十三章DNA操作的基本技术
The Basic Technologies for DNA Manipulations
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第一节 核酸印迹技术与分子杂交
Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization
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什么是核酸分子杂交
核酸分子杂交(nucleotide molecular hybridization)
以DNA的变性、复性为理论基础
指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后,形成异源双链的过程
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一、Southern 印迹可用于分析基因拷贝数的变化
由E. M. Southern在1975年提出
可用于分析基因拷贝数的变化
基本操作过程包括
待测DNA样品的制备和基因探针的标记;
待测DNA样品的电泳分离;
电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物;
特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交,放射自显影或显色检测目的DNA的存在。
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Southern印迹分析基本流程
滤纸
NC膜
凝胶
滤纸
电泳转移杂交,显影
酶切DNA样品上样 DNA印迹
重物
缓冲液
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二、Northern 印迹和RT-PCR可用于分析基因转录水平的变化
Northern blot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上,定性分析mRNA的常用方法;
RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增,进行RNA定性或定量分析的一种方法;
二者均可用于分析基因转录水平的变化。
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三、原位分子杂交技术可用于基因及其表达产物的定位分析
原位杂交(in situ hybridization,ISH)即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术;
可用于基因及其表达产物的定位分析。
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(一)利用原位杂交技术进行基因定位分析
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)
基因组原位杂交(genome in situ hybridization,GISH)
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FISH
箭头所示为杂交信号,结合带型分析可判断染色体位置
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(二)利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位
RNA原位杂交
整体原位杂交(Whole mount in situ hybridization, WISH)