真鲷虹彩病毒rsiv荧光pcr检测试剂盒说明书.docx

真鲷虹彩病毒（RSIV）荧光 PCR 检测试剂盒说明书
1、试剂盒简介货
真鲷虹彩病毒（RSIV）荧光 PCR 检测试剂盒主要感染当年草鱼种和青鱼，死亡率可达80%以上。其它淡水鲤科鱼，如鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲤鱼感染后没有临床症状，但ml×1 管
（注：核酸提取试剂可使用本公司生产的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取试剂盒》）

3、样本采集,存放及运输

样本采集：所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。

取新鲜鱼类组织脏器（肝、脑、脾、肾）2g 于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加 5ml PBS 混匀，2 000r/min 离心 10min 取上清转入无菌离心管中备用。或取有可疑细胞病变的细胞悬液用于检测。
存放：研磨后的样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融 3 次）。
运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

4、一步法 RT-PCR 检测

操作方法

样本的处理（在样本制备区进行）：
取 n 个灭菌的 mL Eppendorf 管，其中 n 为被检样品与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），做标记。(注：试剂盒中的阳性对照直接作为 PCR 检测的模板，无需提取核酸)
每管加入 600 mL 裂解液，分别加入被检样本和阴性对照各 200 mL，一份样本换用一个吸头，再加入 200 mL 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀），于 4℃ 12 000 r/min 离心 15 min。
取与 相同数量灭菌的 mL Eppendorf 管，加入 500 mL 异丙醇（-20℃预冷）， 做标记。吸取 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500mL，不能吸出中间层，颠倒混匀。
于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 mL 75％ 乙醇，颠倒洗涤。
于 4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。
4 000 r/min 离心 10s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。
加入 11 mL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。
【也可参照《病毒 RNA 柱式提取试剂盒说明书》（货号：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】。
注：提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。

、试剂准备

扩增