脲酶值测定.ppt

脲酶值测定
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1926年，美国生化学家Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，并证明了脲酶的本质是蛋白质。1946年获得诺贝尔化学奖。
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酶
是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催脲酶值测定
第1页，本讲稿共17页
1926年，美国生化学家Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，并证明了脲酶的本质是蛋白质。1946年获得诺贝尔化学奖。
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酶
是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。
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酶的特征常数
Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度
酶促反应的特征常数只与酶的结构、底物和反应环境（如温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。
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实 验 目 的
阐述酶促反应中特征常数的特点和意义；
说出利用比色法进行Km值测定的整个操作步骤；
思考Km值的测定对临床工作中的意义。
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一 、原理
O C
NH2
NH2
+
2H2O
脲 酶
（NH4）2CO3
+ 6NaI + 8KI + Na2CO3 + 6H2O
(NH4)2CO3 + 8H2O + 4(KI)2HgI2
2O
Hg
Hg
NH2I
碘化双汞铵（橙黄色）
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米—曼氏方程（Michaelis-Menten equation）
V=
Vmax [S]
Km + [S]
米-曼氏方程解释：
当[S]Km时，v＝ Vmax [S] /Km， 即v正比于[S]
当[S]Km时，v≈ Vmax, 即[S]而v不变
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Km值：当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol／L。
Km值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。
Km + [S]
Vmax [S]
V
2
Vmax
=
Km=[S]
=
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底物浓度对酶促反应速度的影响
v
Vm
Vm
2
0 [S]
[S]与v关系：
当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应
当[S]较高时，[S]与v不成比例
当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应
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Km值与 Vmax值测定
双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）
1 = Km 1 + 1
V Vmax [S] Vmax
1/V
-1/Km 0 1/[S]
斜率= Km/ Vmax
1/Vmax
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酶促反应的原料
底物（脲液）
酶（脲酶液）
酶促反应所需的缓冲液（PBS，蒸馏水等）
酶促反应发生的环境（碱性条件，加入NaOH；温度，37℃）
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操作中每种试剂务必摇匀
煮沸脲液时注意试管口不能对人，变性脲酶液要煮沸变性彻底
试管一定要清洗干净，防止其他残留液体对实验的影响
各组试管加样注意一致性，防止人为加样造成的误差。重复测值，取平均数值
注意事项
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实验操作
管号
1
2
3
4
对照
脲液加入体积(mL)





1/15PB（mL）





脲酶液（mL）




--
煮沸脲酶液（mL）
-
-
-
-

摇匀 ，37度水浴15min
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100g/L ZnSO4





蒸馏水
3
3
3
3
3
NaOH





滤液/mL
1
1
1
1
1
蒸馏水/mL
2
2
2
2
2
显色液/mL





充分摇匀，静置5min，过滤，分别在滤液中加入以下试剂
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迅速摇匀，用721型分光光度计，420nm，以对照调