土壤中分解尿素尿素的细菌的分离与计数.ppt

微生物的培养与应用
课题2:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、课题目标
研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。
二、课题重点与难点
重点：
对土样的选取和选择培养基的配制是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
实验方案有两种
一种方案：
　　可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
四、实验案例
实验的具体操作步骤如下:
 
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
土壤中某样品细菌的分离与计数
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～ mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

将涂布好的培养皿放在30 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。
比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
思考题

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
操作提示
[一]无菌操作
1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
[二]做好标记
注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。
[三]规划时间
六、课题成果与评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。
例如：鉴别大肠杆菌培养基
大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。
（二）样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，