荧光免疫试验课件.ppt

关于荧光免疫试验
现在学习的是第1页，共53页
掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色与结果判断。
熟悉：荧光物质。
了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫技术的应用。
教学目的
现在学习的是第2页，是第19页，共53页
一、基本原理
特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。
间接荧光抗体染色法示意图
第二节 间接免疫荧光试验
现在学习的是第20页，共53页
间接免疫荧光法示意图
现在学习的是第21页，共53页
现在学习的是第22页，共53页
间接法：
优点：敏感度高于直接法
制备一种荧光抗体可检测多种抗原
既可用于检测抗原，也可检测抗体
缺点：易出现非特异性荧光
方法较麻烦
操作时间较长
应用：自身抗体的检测
现在学习的是第23页，共53页
标本片上滴加特异性抗体
37℃30min PBS洗涤 滴加二抗
37℃30min PBS洗涤 镜检
二、实验方法
现在学习的是第24页，共53页
三、注意事项
：一小时内或2~8℃保存4小时，
：①阳对：阳性血清+荧光标记物
②阴对：阴性血清+荧光标记物
③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
，避免干燥
,始终保持在未知抗原标本上
现在学习的是第25页，共53页
-：无或仅见极微弱荧光。
+：荧光较弱但清楚可见。
++ ：荧光明亮。
+++：耀眼强荧光。
特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-或±。
根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
荧光抗体染色及结果判断
现在学习的是第26页，共53页
第三节 流式荧光免疫试验
流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):
采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法。
悬浮阵列；流式微球阵列
现在学习的是第27页，共53页
第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验
现在学习的是第28页，共53页
其他荧光免疫试验
时间分辨荧光免疫测定
荧光酶免疫测定
荧光偏振免疫测定
现在学习的是第29页，共53页
自发荧光寿命短:1ns～10ns
镧系元素寿命长:10μs～1000μs
短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光
（一）基本原理
时间分辨检测原理示意图

一、时间分辨荧光免疫测定
现在学习的是第30页，共53页
:激发光谱和发射光谱的波长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。
镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
现在学习的是第31页，共53页
发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少
激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高

时间分辨荧光免疫测定
现在学习的是第32页，共53页

比活性 ：单位时间内每个标记分子
可被探测到的信号量。
Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒
大大提高了荧光标记物比活性
时间分辨荧光免疫测定
现在学习的是第33页，共53页
结合β-二酮体
Eu3+解离
酸性增强液
荧光增强
Eu3+标记抗原抗体复合物

时间分辨荧光免疫测定
现在学物和标记方法
时间分辨荧光免疫测定
现在学习的是第35页，共53页
（三）方法类型
双抗体夹心法
固相抗体竞争法
固相抗原竞争法
时间分辨荧光免疫测定
现在学习的是第36页，共53页
（三）方法类型
时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图