骨结核的偏方治疗方法.ppt

骨结核的偏方治疗方法.pptPCR技术在Nm、Hi、?普通PCR?实时荧光定量PCR普通PCR?Polymerase Chain Reaction?在一对特异性引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。PCR基本原理?类似于DNA的体内复制过程;?需要相关DNA聚合酶的参与;?适宜的离子浓度和核苷酸单体;?依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;PCR基本步骤1——变性(Denature)模板DNA经93℃(93-95℃)左右加热一定时间后(1min),双链DNA解离为单链5’3’5’3’3’5’3’5’PCR基本步骤2——退火(Anneal)变性后温度快速冷却至55℃(40℃-60℃)左右,引物与模板DNA单链的互补序列以氢键配对退火温度是影响PCR特异性重要因素退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及浓度,还有靶片段的长度正向引物反向引物5’3’3’5’3’5’3’5’PCR基本步骤3——延伸(Extension)DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应(70℃~75℃)延伸时间:1Kb以内的DNA片段,1min ;时间过长会导致非特异性扩增; 对低浓度模板的扩增,延伸时间稍长extensionextension5’3’ 5’3’3’3’5’5’反应体系(终浓度)PCR 缓冲液1ХdNTP 50~~1μMMg2+ ~~5u/100μl模板DNA ~:阴阳对照PCR电泳及结果显示凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。琼脂糖凝胶用于分离200bp~50Kb的片段;操作简单、快速,且分离范围广,分辨率高聚丙烯酰胺凝胶用于分离5bp-500bp的片段;效果好、分辨率极高,相差1bp的DNA片断能分开用于核苷酸多态性的分析不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度(%,W/ V )DNA分子的有效分离范围(kb) - - - - -2