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免疫亲和纯化和免疫沉淀
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蛋白质的功能
蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。
现模进行，半
　 天内即可完成。
　4、不仅适用于纯化抗原，也可用来分离经过初步纯化的抗体，乃至
　 所有能与相应配体有效结合的生物分子。
　5、抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天
　 然状态或近似天然状态的抗原。
　6、需要适当纯化的抗体，不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，
　 但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠 。
　7、不能用于定量测定。
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免疫亲和纯化技术发展历史：最早是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和纯化，根据其自身交联产生大量多聚体和不溶性基质原理收集抗原。随后利用抗体与惰性微珠共价结合，虽然这是一种简单的结合，但抗体的许多反应性因缺乏定位作用或抗体的过量结合而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A和蛋白G微珠共价连接后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种最适用和有效的纯化方法。亲和层析技术最先是由Cuatrecasas等人建立（1968年）。

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影响免疫亲和层析纯化效果的因素
　抗原初始相对浓度（即纯度）：是决定最终产物纯度极为重要的因素。
　抗原与抗体的亲和力：是免疫亲和纯化层析过程中最麻烦的问题。高亲和力抗体（>10-8 mol/L)能在1 h以内达到有效的分离，而低亲和力的抗体(﹤10-6 mol/L）即使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。使用针对同一抗原多个表位的多克隆抗体以增强亲和力的方法固然可结合较多的抗原，但增加了洗脱的困难性。只有当所需的最终产物为变性蛋白时，才选用识别多个表位的抗体。
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免疫亲和纯化的关键：高亲和力与容易洗脱的优　　
　　　　　　　　　　化组合。
常见错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。
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1．亲和层析支持物的选择:作为亲和层析支持物须符合以下要求：①非特异性吸附低；②液体通过时流速要快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；④必须有合适的、丰富的化学基团，能有效地与蛋白质或其它化合物结合；⑤必须带有丰富的微孔，以增加结合容量。符合以上5个条件的支持物有琼脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。
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2．配体的选择:所谓配体系指具有亲和性的双方，作为免疫亲和层析专指抗原与抗体。良好的配体必须具备以下3个条件。
（1）抗原或抗体必须单一特异性：抗原或抗体的纯化效果决定于固相中配体的纯度。
（2）抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和力决定于抗原决定簇的性质和数量。对抗体来说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间，如马抗血清亲和力较低，免疫血清亲和力较高；免疫时间短的亲和力低。但是，亲和力太强也不利，因为解离抗原抗体复合物所需要的条件就要强烈，从而可造成蛋白质的变性。例如用低pH（～）或高盐（如6 mol/L盐酸胍）可使部分抗原或抗体活性降低或丧失。
（3）配体必须有一个适当的化学基团：这个基团不参与配体和大分子的特异结合，但可用来连接支持物，而且这种连接不应当影响配体与大分子结合的亲和性。
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3．抗原或抗体与支持物的结合将抗原或抗体结合到支持物上的方法目前有20多种，但可归结为载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法4类。
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结合法的一般步骤是先活化支持物上的功能基团，然后将抗原或抗体连接到这些活化的基团上。用来发生交联的化学反应必须足够温和，不致使抗原或抗体遭到破坏。交联后，要彻底清洗支持物，以除去剩下的未交联的物质。
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最常用的支持物是Separose 4B，将此支持物与溴化氰在pH11时进行处理，则能使支持物活化。此时溴化氰与支持物上的羟式反应形成氨基甲酸酯基团。加入溴化氰的量取决于支持物的量。如果希望取代程度提高，则加入溴化氰的量也要提高。交联时首先要注意加入抗原或抗体的浓度。通常在交联反应混合物中的交联蛋白质浓度应是亲和分离浓度的20～30倍。这样，溴化氰浓度也必须提高到 200 mg/ml凝胶。若希望最终产物含量较少，所加入的溴化氰也应减少。交联时的pH也应注意，～10时，活化的琼脂糖珠很不