免疫共沉淀步骤.doc

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在进展免疫沉淀前，需要取一局部断裂后的染色质做Input对照。Input是
此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。
“不过〞用它做coIP有明显的缺陷；
要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪〞。
伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者，从技巧上来讲，如果要想获得设定、预想的相互作用结果，可以从几个角度着手——此类结果可重复。
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很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐〔〕或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，*-，。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对*些体外生化反响的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。例如，纯化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用盐浓度漂洗，。所以，在生化领域的coIP分析中，很多实验体系的盐浓度是比生理盐浓度更高的。当然，不排除*些弱相互作用需要生理盐浓度，但这种情况不多见；也容易跟瞬时的相互作用混淆，*些实验中的弱相互作用实际是由于生化反响的瞬时性，且缺乏有效的截留、富集手段，诸如酶和底物。
很多非生化领域的，喜欢在生理盐或更低盐浓度下进展coIP，这大大增加了假阳性的几率——很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。这也成为了获得“设定的〞相互作用的有效手段。
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现在已经存世的相当多的实验论文和数据，其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达，甚至原核GST pulldown获得的；笔者认为，在阅读这类文献时，大家要特别小心，多长一个心眼——即始终抱疑心的态度。并非说一定不可取，但是有一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充源性蛋白相互作用的证据，否则该结果一律不采信。
在“WB指南“里面我提过，血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别〔其实也是一种相互作用〕，则同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，为什么不可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？
因此，如果想要“特定〞的相互作用，可以考虑过表达所有的蛋白，就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜外表受体也不稀奇。
，削弱对非特异性结合的拮抗。
NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。因此，减少或不添加NP40也可以辅助“预期〞目的。
实际上，掌握a、b两点技巧，根本上可以“无往而不胜〞——彻底搞定一切“想要的〞相互作用。
基于以上的原因，如果想获得切实可靠的相互作用数据，则裂解液的选取相当讲究。
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盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐？因为钾盐会更容易跟*些试剂〔或离子〕形成沉淀，诸如SDS，因此在*些情况下，钾盐会对后续的*些实验带来未知的麻烦，所以一般