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细胞凋亡和细胞坏死
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细胞凋亡的生理和病理意义
、生长:指趾间隙形成；
:组织细胞更新(上皮组织/血细胞/衰老细胞)、生理器官内分泌调控（子宫产后复员/月经期子宫内
神经酰胺
多途径
R
SAPK/JNK
P53 基因
NF-kB,JNK/AP-1途径
激活bax or 下调bcl-2
ROS
mtDNA
㈢ 细胞凋亡相关基因
抑制凋亡基因：bcl-2
促进凋亡基因： fas，P53
双向调控基因： c-myc，bclx
Bcl-2抗凋亡机制
①直接的抗氧化
②抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质
③抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用
④抑制Caspases激活
⑤维持细胞钙稳态
细胞凋亡发生机制
（一）氧化损伤
（二）钙稳态失衡
(三) 线粒体损伤
（一）氧化损伤机制
氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态——后果：诱导细胞凋亡。
（二）钙稳态失衡引起细  胞凋亡的可能机制
+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降解DNA链；
，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；
，加速细胞凋亡相关基因的转录；
+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。
细胞凋亡的生物学意义
从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。
淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终伴随着细胞凋亡。
细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接的联系。

细胞增殖与死亡的速度平衡失调。
病毒表达抗凋亡蛋白。
细胞凋亡的检测
随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。





一．细胞凋亡的形态学分析
细胞凋亡的形态学变化主要表现为：细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细胞连接(cell junction)，微绒毛(microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的新月状体(crescents)，形成凋亡小体(apoptotic body)等。
细胞凋亡的形态学检测方法
检测方法
可鉴定凋亡细胞特征
光学显微镜
相差显微镜
透射电镜

聚焦激光扫
描电镜
扫描电镜
流式细胞仪
缩时摄影术
细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈
细胞发泡、凋亡小体
微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体
凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位
细胞膜表面泡状鼓起
低前向散射光(FSC)、高侧向散射光(SSC)
凋亡细胞的形成过程
二. DNA降解分析
DNA降解过程的特点：
1. 发生于凋亡早期，由内源性核酸内切酶激活引起
2. DNA在核小体连接部位断裂，产生180－200bp为最小单位的单体或寡聚体片断
3. DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体
(一) DNA凝胶电泳
原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的“ 梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后坏死细胞的DNA分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电泳时形成“ 涂片状”(smear)。
普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影(32PdATP或32PdCTP连接到DNA片断的3’ 端)
(二)原位标记法
TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。
原理：在TdT的作用下，带有标记物的dUTP被连接在断裂DNA3’末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。
应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞
(三) ELISA法
原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复合物，与核小体中的DNA片断结合，最后加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度