岗梅枝枯病病原鉴定.doc

岗梅枝枯病病原鉴定
摘要 为明确引起岗梅Ilex asprella枝枯病的病原,对从广东梅州采集的岗梅枝枯病病部分离的致病菌株Gangmei 2进行了形态学观察,并运用MEGAX构建了病原菌株rDNA内转录间隔区(intern重复。于28℃光照条件下保湿培养5~10 d后,观察分离物的致病情况。对接种后发病的组织再次进行病原菌分离纯化,比较该分离物与接种病原菌的形态异同。
病原菌的形态观察
将4℃斜面保存的菌株转至PDA平板上,于28℃培养箱中培养3~7 d,观察并记录菌落特征,每日测定菌落大小。待菌落产孢后利用镜台及目镜测微尺测定分生孢子的大小,记录并统计。
病原菌的分子鉴定
采用Chi等[6]的方法提取病原真菌总基因组DNA,对rDNA内转录间隔区(ITS)进行扩增。扩增所用的引物为ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)[7]。PCR反应体系(25 μL):2×Taq PCR Green Mix μL、DNA模板5 μL、5 μmol/L ITS1和ITS4各1 μL、Nucleasefree Water μL;PCR扩增反应程序:94℃預热3 min;94℃变性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃再延伸7 min;4℃保存。 扩增结束后取5 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳,最后将目标片段送往华大基因科技股份有限公司进行测序。测序结果与GenBank中的数据进行BLAST同源性比对,并运用MEGA 。
2 结果与分析
岗梅枝枯病的症状特点及病原菌致病性测定
岗梅枝枯病主要危害岗梅的主干、侧枝和嫩梢,引起发病枝条萎蔫、干枯,树势衰弱,生长缓慢。嫩梢发病时枝条由绿色变为深褐色,嫩叶和幼茎失水,干枯(图1a~b)。主干和侧枝初侵染时,病斑处失绿变褐,呈条状,病斑中心呈现出黑褐色的斑块,病斑周围浅褐色,病斑逐渐扩散侵染,后整个病斑成为黑褐色,严重时病斑环绕大部分主茎,导致病斑以上部位因养分输送受阻而失水失绿干枯。
从病组织上获得3个分离物:Gangmei 1、Gangmei 2和Gangmei 3。利用针刺法对其进行致病性测定,结果显示,只有分离物Gangmei 2在接种9 d后,岗梅枝干部出现深褐色病变,病变部位中间有白色羽状物(图1c),与原采回的标本岗梅枝枯病在田间自然病害特征一样,病斑有逐渐扩大的趋势,分离物Gangmei 1、Gangmei 3未引起岗梅产生病变。从接种后岗梅发病茎部的病健交界处组织上(图1c)再次进行病原菌的分离纯化,此次分离的菌物在PDA平板上的菌落形态(图2a~b)和分子特征(ITS)与原接种体一致。
岗梅枝枯病病原菌的形态学特征
Gangmei 2在PDA培养基上于28℃培养箱中培养5 d后的菌落近圆形,边缘规则,正面为白色丝绒状,反面淡黄色,有轮纹,菌体由内而外呈波浪形扩张,整体蓬松,10 d后产孢(图2a~b);对病部进行切片观察到分生孢子盘埋生于寄主表皮下,黑色,单腔,分生孢子整齐地排列在分生孢子盘内(图2c)