免疫沉淀类实验演示文稿.ppt

免疫沉淀类实验演示文稿
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（优选）第单元免疫沉淀类实验
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在琼脂凝胶中，待检人血清IgG和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀温箱温育24h，观察结果。如果沉淀环不清晰，可用生理盐水浸泡2~3h。
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操作示意图
浇板
扩散
打孔
加样
1 2 3 4
5 6 7 8
结果判断
第1、2、3、4、5孔—标准蛋白
第6、7孔—待检抗原
第8孔—阴性对照
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结果判断
绘制标准曲线：
以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标，相应孔中的IgG含量为纵坐标，在半对数纸上按Fahey法绘制出标准曲线。
结果判定：
待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即待检标本血清中Ig的实际含量。
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实验讨论
单向免疫扩散试验方法简便、易于操作，且重复性和线性均可信赖。但敏感度稍差，观察结果所需时间较长，每次需做参考血清对照，不可一次做成，长期使用。应用此方法除检测人血清IgG含量外，还可用于健康人群或患者血清中IgA、IgM、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含量的定量测定。
北华大学 王雪松
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实验三 对流免疫电泳
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在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗体的扩散具有一定的特点。，大部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；而大部分抗体属于IgG，在此种pH条件下只带微弱的负电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉淀线。
实验原理
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实验器材和材料
试剂：
人血清、抗人血清、 、用巴比妥缓冲液配置1%琼脂 。
仪器：
电泳槽、电泳仪、水浴箱 。
材料：
孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、吸管、吸球等 。
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制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用75%乙醇冲洗干净，晾干备用。将1%巴比妥琼脂融化后，置56℃水浴中备用。用吸管吸取4~，室温放置，待凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。
加样：用微量加样器分别吸取抗原10μl加入阴极侧孔内，抗体10μl加入阳极侧孔内，所加样品切勿外溢。
电泳：将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，，琼脂板两端分别用盐桥与缓冲液相连。控制端电压为5~6V/cm板长，电泳30~60min。电泳完毕后，切断电源。
实验方法
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操作示意图
浇板
电泳
打孔
加样
两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物 。
Ag
Ab
﹣
﹢
Ag Ab
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在抗原和抗体两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物。如果沉淀线不够清晰，于湿盒中37℃保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。
结果判断
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北华大学 王雪松
此方法简便、快捷。敏感性比双向免疫扩散法高8~16倍。需要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结果难以判断。对流免疫电泳在临床常用于某些抗原的定性检测（如AFP、HBsAg等），同时也可用于抗原的半定量测定，或根据沉淀线的位置、形状对抗原和抗体进行相对浓度的分析。由于该方法分辨率差，当多种抗原抗体系统同时存在时，形成的沉淀线常重叠，难以分辨。
实验讨论
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实验四 抗原物质的变化及性质分析
（设计性实验）
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是指能够刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与相应免疫应答的产物在体内或体外发生特异性结合反应的物质。
抗原概念
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实验原理
大分子的抗原物质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用，生物的某些结构和性状都与这些物质有关。现代分子生物学经常采用一些方法对大分子物质进行有目的的改造，如盐析、甲醛处理、加热、紫外线照射、超声波等，如处理不当这些