谈白藜芦醇对肾小球内皮细胞氧化应激损伤的保护作用.doc

谈白藜芦醇对肾小球内皮细胞氧化应激损伤的保护作用.doc谈白藜芦醇对肾小球内皮细胞氧化应激损伤的保护作用随着对糖尿病、炎症、心脑血管疾病和衰老等疾病机制的研究, 氧化应激损伤和抗氧化保护作用越来越被重视。体内大量产生的活性氧簇(ROS) 通过氧化作用导致细胞和组织损伤,引发糖尿病、炎症等疾病。白藜芦醇有抗炎、抗氧化、抗癌和抗菌的功效, 能够治疗炎症和感染等疾病,清除 ROS ,提高超氧化物歧化酶(SOD) 和过氧化氢酶(CAT) 活性,还能通过活化抗氧化防御通路,防治糖尿病中氧化应激导致的肝肾损伤。本研究建立肾小球内皮细胞株氧化应激损伤模型, 旨在研究虎杖有效组分白藜芦醇对肾小球内皮细胞氧化应激损伤保护的分子机制。材料与方法一、材料肾小球内皮细胞( 上海华山医院) ,白藜芦醇系虎杖提取物(上海沐川生物科技有限公司)。 DMEM 培养基、胎牛血清(Gibco 公司); 总 RNA 快速提取试剂盒、逆转录试剂盒、 SYBR GreenMaster Mix(Takara 公司);BCA 蛋白浓度测定试剂盒、 MTT 试剂盒[ 生工生物工程( 上海) 股份有限公司]; 聚偏二氟乙烯膜和 ECL 化学发光液(Millipor e 公司);β-acti n 抗体(Proteintec h 公司); 单磷酸腺苷激活的蛋白激酶α 亚基(AMPKα) 抗体和磷酸化 AMPKα(p-AMPKα) 抗体(CST 公司); 沉默调节蛋白 1(SIRT1) 抗体(Millipore 公司); 羊抗小鼠二抗和羊抗兔二抗(Jackson 公司) 。二、方法 1. 白藜芦醇处理肾小球内皮细胞细胞铺 6 孔板, 培养至完全贴壁, 将细胞分为五组: 对照组(A组) 用常规培养基培养;B 组为过氧化氢(H2O2) 诱导肾小球内皮细胞氧化应激损伤模型组,使用 H2O2 1×105 nmol/L 诱导处理细胞 12h ,换为常规培养基;C1 、C2 和 C3 组均为 H2O2 诱导后不同剂量白藜芦醇处理组,首先使用 H2O21×105 nmol/L 诱导处理细胞 12h ,然后分别使用白藜芦醇 1μg/ml(C1 组)、 μg/ml(C2 组)、 μg/ml(C3 组) 处理。白藜芦醇溶于二甲基亚砜(DMSO) ,各组细胞培养基的 DMSO 终浓度都为 % 。细胞培养 24h 后提取各组细胞蛋白和 RNA 待检。 法检测白藜芦醇对 H2O2 损伤的肾小球内皮细胞存活率的影响细胞铺 96 孔板, 培养至完全贴壁, 将细胞按 A、B、 C1、 C2、 C3 组处理后继续培养 24h , 每孔加 10μl MTT(5mg/ml) 溶液, 37℃孵育 4h ,小心弃去上清液,每孔加 100μl DMSO ,振荡 10min 终止孵育,用酶标仪于 570nm 波长测吸光值度(Molecular Devices , SPECTRAmax Plus384) ,实验重复 3 次,计算细胞存活率。 3. 实时定量 PCR(qRT-PCR) 检测 SIRT1 和 AMPKαmRNA 表达 TRIzol 法提取各组细胞总 RNA 并测定浓度,取 1μg RNA 参照 Takara 逆转录试剂盒说明逆转录为 c