整个基因克隆实验流程.doc

一、组织总 RNA 的提取 1. 取暂养草鱼,冰上放置一段时间,然后解剖,剪取肠道 50~100mg ,放入研钵中,加入液氮迅速研磨,然后加入 1ml 预冷 TRIzol 试剂,充分研磨至无颗粒物存在。 2. 转移到离心管中,室温放置 5min ,使细胞充分裂解; 1ml Trizol 加入 200 μl 氯仿,盖上盖子,迅速充分摇匀 15s ,然后室温放置 3min ; ℃, ,12000g 离心 15min ; 此时混合物分为三层,下层红色的苯酚氯仿层,中间层和上层无色水相; RNA 存在于无色水相中; 5. 小心吸取上清液, 千万不要吸取中间界面, 否则有 DNA 污染; 转移至一个新的离心管, 加入等体积的异丙醇,轻轻混匀; 6. 室温放置 10min ;4℃, ,12000g 离心 10min ; 7. 弃上清,加入 1ml 75% 乙醇洗涤;涡旋,悬浮沉淀; 4℃, ,12000g 离心 5min ; 8. 弃上清;可以再次用 75% 乙醇洗涤沉淀; 9. 弃上清; 用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇, 注意不要吸取沉淀; 室温放置 5mi n 晾干沉淀;( RNA 样品不要过于干燥,否则极难溶解) 10. 沉淀中加入 30μl RNase-free 水,轻弹管壁,使 RNA 溶解。 RNA 质量检测(1) RNA 纯度的检测: 测定其 OD 260和 OD 280 的值,根据其 OD 260/ OD 280 的比值,当其比值在 ~ 之间,说明提取的总 RNA 纯度比较高,没有蛋白质和基因组的污染。(2) RNA 完整性的检测:取 2μ lRNA ,与 2μl 溴酚蓝混匀,用 1% 的琼脂糖进行凝胶电泳, 20min 后,在凝胶成像系统中观察效果。当 28S 与 18S 条带清晰,且亮度比大约是 2:1 时, 5S 条带若隐若现,而且没有其它条带时,说明完整性不错,可以用于下游逆转录实验。二、逆转录根据逆转录试剂盒( TOYOBO 公司)说明书进行,反应体系及条件如下: 试剂使用量( μl) Rn ase Free H 2O -Y Oligo ( dT )1 Total RNA ( <1000ng )Y Total Volume 12 65℃, 5min 后,立即置于冰上。试剂使用量( μl) 上一步变性后的 RNA 溶液 12 5× RT Buffer 4 dNTP Mixture (各 10mM ) 2 Rn ase Inhibitor ( 10U/ μl) Rever Tra Ace1 Total Volume 20 然后放置于 PCR 仪上, 反应程序为: 42℃,60min ; 99℃,5min ; 16℃,5min 。所得 cDNA 放置于-20 ℃保存。三、 PCR 反应反应条件: 95℃, 预变性 3min ; 94 ℃变性 30s , 55℃退火 30s , 72℃延伸 45s ,共 35 个循环; 72℃延伸 10min 。反应结束后,取 5μl PCR 产物, 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。四、 PCR 产物的分离,回收和纯化 PCR 反应得到目的条带后,加大反应体积,然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得 DNA 贮存于-20 ℃。五、目的片段与载体的