解淀粉芽孢杆菌Y11产淀粉的酶条件优化.doc

解淀粉芽孢杆菌Y11产淀粉的酶条件优化
摘要:为了提高解淀粉芽孢杆菌Y11的产淀粉酶能力,研究了其培养基成分(碳源、氮源、无机盐),及发酵培养条件(温度、pH值、接种量)对产生淀粉酶活的影响,通过单因素试验、Box-Behnke点。试验以前期从烟叶表面筛选出的降解淀粉的解淀粉芽孢杆菌Y11为研究对象,对其产酶条件进行优化,以淀粉酶酶活为响应值,最终得到其最佳培养基成分及发酵条件。
1 材料与方法
材料与试剂
菌株,由前期试验,从烟叶中筛选出1株可以高效降解淀粉的菌株,通过形态观察、生理生化试验和分子鉴定等手段,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌;葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖,以及(NH4)2SO4,MgSO4,CaCl2,FeSO4,K2PO4,天津市凯通化学试剂有限公司提供;酵母膏、蛋白胨、尿素等,北京奥博星生物技术责任公司提供;DNS试剂:称取5 g的3,5 -二硝基水杨酸,边搅拌边加入到300 mL的去离子水中,缓慢加入5 g NaOH,在50 ℃水浴锅中水浴加热、搅拌溶解,然后加入100 g酒石酸钾钠,1 g的无水亚硫酸钠,搅拌溶解澄清后冷却至室温、用水定容至500 mL,贮藏在棕色试剂瓶中,在黑暗处放置1周以上使用。
752N型紫外可见分光光度计,河北润联科技开发有限公司产品;数显恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司产品;BSA124S型电子天平,赛多利斯科仪器(北京)有限公司产品;Hicen FR型高速冷冻离心机,德国英雄试验仪器公司产品;GR85DA型高压灭菌锅,致微仪器有限公司产品。 试验方法
培养方法
种子培养:挑取菌株单菌落接种到50 mL种子培养液中,~,得种子液,将种子液放置4 ℃冰箱中备用。
初始培养基:葡萄糖10 g, g, g, g,1 000 mL,于121 ℃,20 min条件下灭菌。
发酵培养:取种子液1 mL接种于100 mL发酵培养基中,在37 ℃,200 r/min条件下发酵培养40 h。
淀粉酶活的测定方法
将发酵液高速离心(4 ℃,10 000 r/min,10 min),液体即为粗酶液。取1 mL粗酶液,加入到1 mL, 5 g/L的可溶性淀粉溶液中,酶解时间20 min,加 mol/L盐酸溶液1 mL 混合均匀,加3 mL DNS试剂,沸水处理反应5 min,然后稀释到25 mL,测吸光度,计算酶活。对照为灭活的酶液,按照上诉操作。定义1 h酶解淀粉产生1 mg葡糖糖的酶量为一个酶活为 1 U,单位为U/mL。
酶活=葡糖糖含量×N(60/n).
式中:n——酶解时间;
N——粗酶液稀释倍数。
葡萄糖标准曲线的绘制
g,溶解到蒸馏水中,加水定容至100 mL, g/L的葡萄糖溶液,分别取0,2,4,6,8,10标准溶液定容至50 mL容量瓶中,即为质量浓度0,, ,,,, g/L的标准溶液,分别取2 mL加入3 mL DNS,沸水浴反应5 min,冷却后,以去离子水做空白对照校正,用紫外分光光度计于波长550 nm处测吸光度A。
菌株的培养基成分的优化
(1)碳源试验。在初始培养基的基础上,氮源为蛋白胨10 g/L,酵母5 g/L,无机盐为NaCl 5 g/L,分别以10 g/L玉米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖为碳源,酶活为响应值,得出最佳碳源,再考查最佳碳源量对酶活的影响,分别取最佳碳源量5,10, 15,20,25 g/L,于37 ℃,200 r/min条件下发酵培养40 h,测产生淀粉酶活性。
(2)氮源试验。在初始培养基的基础上,以淀粉质量浓度为15 g/L,分别以10 g/L蛋白胨、(NH4)2SO4、酵母膏、尿素为氮源,测定酶活性,再对最佳氮源的添加量进行优化,其质量浓度分别为5,10, 15, 20,25 g/L,发酵条件及测定方法同上。
(3)无机盐试验。在初始培养基的基础上,碳源为可溶性淀粉15 g/L,氮源为酵母膏15 g/L, g/L K2HPO4,CaCL2,MgSO4,FeSO4作为无机盐,再对最佳无机盐的添加量进行优化,,,,, g/L,发酵条件及测定方法同上。
响应面分析试验
采用Design Expert -Be