第三节蛋白质结构.ppt

蛋白质的一级结构
二
蛋白质的空间结构
三
肽键和肽
一
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第一页，共八十六页。
肽键（Peptide Bonds）是氨基酸连接的基本方式。

一、肽键和肽
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第二页，共八十六ng methods of Primary structure of a protein)
测定蛋白质分子中多肽链的数目。
拆分蛋白质分子的多肽链。
断裂多肽链的二硫键。
测定多肽链的氨基酸组成。
分析多肽链的N末端和C末端残基。
将多肽链断裂成肽段，并分离。
测定各个肽段的氨基酸顺序。
确定肽段在多肽链中的次序。
确定原多肽链中二硫键的位置。
一般原则
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第二十页，共八十六页。
(1)一般要求:
a、样品必需纯（>97%以上）
b、已知蛋白质的分子量
c、已知蛋白质由几个亚基组成
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第二十一页，共八十六页。
(2) 测定步骤
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蛋白质一级结构的测定
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第二十二页，共八十六页。
(2) 测定步骤
分析多肽链的N-末端和C-末端。
多肽链N-端 (amino-terminal)
蛋白质一级结构的测定
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第二十三页，共八十六页。
氨基末端基氨基酸测定
二硝基氟苯（DNFB）法
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第二十四页，共八十六页。
氨基末端基氨基酸测定
丹磺酰氯法
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第二十五页，共八十六页。
Edman法。
氨基末端基氨基酸测定
苯异硫氰酸（PITC）法
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第二十六页，共八十六页。
氨肽酶(amino peptidases)是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。
氨基末端基氨基酸测定
氨肽酶法
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第二十七页，共八十六页。
羧基末端基氨基酸测定
羧基末端---肼解法
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第二十八页，共八十六页。
羧肽酶(carboxypeptidase)是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA 。
目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y.
羧基末端基氨基酸测定
羧基末端---羧肽酶法
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第二十九页，共八十六页。
用LiBH4使C末端氨基酸还原成氨基醇，然后水解，测定氨基酸，即可知C末端氨基酸。
羧基末端基氨基酸测定
羧基末端---硼氢化锂还原法
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H2N-CH-CO-NH-CH-COOH
H2N-CH-CO-NH-CH-CH2OH
LiBH
4
|R1
|R2
|R1
|R2
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第三十页，共八十六页。
（2）测定步骤
。
蛋白质一级结构的测定
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第三十一页，共八十六页。
(2) 测定步骤
。
几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
蛋白质一级结构的测定
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第三十二页，共八十六页。
(2) 测定步骤

还原法:-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基.
SH-CH2-CH2-OH
蛋白质一级结构的测定
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第三十三页，共八十六页。
(2) 测定步骤
氧化法:应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。
蛋白质一级结构的测定
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第三十四页，共八十六页。
（2）测定步骤

根据蛋白质水解
蛋白质一级结构的测定
完全水解（彻底水解）
不完全水解（部分水解）
水解产物是aa 混合物
水解产物是各种大小不同的肽段和aa
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第三十五页，共八十六页。
水解方法
反应条件
产物
优点
缺点
酸水解
6M HCl 或4M H2SO4
共煮20hrs
L-aa
不引起消旋
Trp被破坏；一部分羟基aa (Ser,Thr) 被分解；Asn 和Gln 的酰胺基被水解下来
碱水解
5M NaOH
共煮20hrs
L-aa 和D-aa混合物
不破坏Trp
引起消旋；
Arg 脱氨基生成鸟氨酸
酶水解
生理温度、pH
肽段和氨基酸混合物
不破坏aa
不引起消旋
酶解时间长
Table1-2
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第三十六页，共八十六页。
（2）测定步骤

蛋白质一级结构的测定
多肽链断裂法：酶解法和化学法
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第三十七页，共八十六页。
酶解法:
胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶
多肽链的选择性降解
（2）测定步骤
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第三十八页，共八十六页。
Trypsin ：R1=Lys和