酶工程-张一哲 酶工程整理.docx

生物酶工程主要研究内容(1) 用基因工程技术大量生产酶(克隆酶) 如:尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。用 DNA 重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中, 可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原, 从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。(2 )用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因(突变酶) 如:酪氨酰- tRNA 合成酶,用 Ala5 (第 5 位的丙氨酸)取代 Thr51 (第 51 位的丝氨酸),使该酶对底物 ATP 的亲和力提高了 100 倍。(3 )设计新的酶结构基因,生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。酶工程原理和基本过程菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→酶成品↓原料→前处理→杀菌→酶反应器←酶的固定化↓反应液→产品提取→产品?世界三大酶制剂公司 Novo Nordisk (丹麦) Genencor International( 美国杰能科国际公司) Cuitor( 芬兰) ?三大公司销售额占世界总额的 70% 2 、米氏常数的意义 Km : 米氏常数,物理意义为反应速率为最大速率 V max 一半时底物的浓度,单位与底物浓度同(1)K m 是酶的一个特性常数,K m 大小只与酶性质有关, 而与酶浓度无关。当底物确定, 反应温度, pH 及离子强度一定时, K m 值为常数,可用来鉴别酶。 K m 一般在 1× 10 -6 ~10 -1 mol/L 之间不同的酶 K m 值不同,测定 K m 要在相同测定条件( pH 、温度、离子强度)下进行。(2)K m 值可用于判断酶的专一性和天然产物,若一个酶有几种底物就有几个 K m 值,其中 K m 值最小的底物称为该酶的最适底物,又称天然底物。(3 )可近似表示酶与底物亲和力的大小。真正表示酶与底物亲和力为 K s =k 2 /k 1(注K m=k 2 +k 3/k 1) (4 )已知 K m 可由[ S] 计算 v, 或由 v 计算[ S]。酶活力是指一定条件下,酶所催化的反应初速度; 酶催化反应速度用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。 V=-dS/dt=dP/dt 二、酶的活力单位:表示酶活力大小所用的两个国际单位? 1IU :在最适反应条件下,每分钟催化 1μ mol 底物转化为产物所需的酶量,称一个 IU。?1 Kat :在最适反应条件下,每秒钟催化 1mol 底物转化为产物所需的酶量,称 Kat 单位 1 Kat =6× 10 7 IU;1 IU= 1/60 μ Kat = Kat ?最适条件:最适温度, 最适 pH 、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度要求:(1 )通常很大,使酶饱和;(2 )底物消耗≤ 5% 。试管菌种培养茄瓶菌种培养摇瓶菌种培养孢子(菌体)悬液制备种子罐菌种培养发酵罐发酵发酵液预处理酶的分离纯化精制目前工业用酶大多数来自微生物。经过预先设计, 通过人工操作, 利用微生物细胞的生命活动获得所需酶的技术过程称为酶的发酵生产。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。酶发酵生产的前提之一:选育到性能优良的产酶微生物! 对产酶微生物的要求: (1 )产酶量高; (2 )易培养和管理; (3 )产酶性能稳定; (4 )利于酶产品的分离纯化; (5 )安全可靠、无毒性等。 1960 , Jacob 和 Monod 提出的操纵子学说阐明; 与生物合成相关的四个基因: 调节基因 Regulator gene ; 启动基因 Promoter gene ; 操纵基因 Operator gene ; 结构基因 Structural gene ; 调节基因(R) : 可产生一种变构蛋白, 通过与效应物(effector) ( 包括诱导物和辅阻遏物) 的特异结合而发生变构作用,从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。启动基因( P) (启动子): 有两个位点: (1) RNA 聚合酶的结合位点(2) cAMP-CAP 的结合位点。 CAP :分解代谢物活化剂蛋白,又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein , CRP )。操纵基因( Operater gene ): 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序,能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合,操纵酶合成的时机与速度。结构基因( Structural gene ): 决定某一多肽的 DNA 模板, 与酶有各自的对应关系, 其中的遗传信息可转录为 mRNA , 再翻译为蛋白质。 1. 动物细胞培养的特点?细胞生长速度慢。(需添加抗生素) ?细胞体积大,无细胞壁保护,对剪切力敏感。?反应过程成本高,产品价格贵。?细胞具有锚地依赖性。?原代细胞一般繁殖 50 代。首先,应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的了解; 其次,判断采用的方法