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微生物学目的与要求
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实验十 病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验
目 的
（一）观察病毒包涵体，并掌握其诊断意义。
（二）掌握病毒的形态并了解病毒包膜的获得。
（三）了解病毒培养的三种方法类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、生产疫苗以及研究病毒性质等。
鸡胚和实验动物一样，为一整体动物，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的组织分化程度低，病毒易于繁殖，感染了病毒的膜结构和液体中，含有大量病毒；鸡胚来源充足，操作简单、通常本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗体为其优点，但除产生痘疱的病毒及引起鸡胚死亡的病毒外，通常不产生特异性的感染指征，必须利用第二个试验系统来测定
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病毒的增殖。
常用的鸡胚接种方法有四种，即绒毛尿囊膜上接种法、羊膜腔接种法、尿囊接种法及卵黄囊接种法。根据不同病毒和不同目的采用合适的接种方法。
（一）尿囊腔接种法（录像）
【材料】
副流感病毒10－3稀释液，10～12日龄鸡胚、无菌1毫升注射器及7号针头、电动磨蛋器、检蛋灯、弯头小镊子、蛋架、碘酒棉球、胶布、大头针、无菌试管、无菌毛细吸管。
【方法】
1. 选用10～12日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察鸡胚是否存活，根据如下：①小血管是否清晰；②胚胎是否活动，观察小鸡的眼睛黑点是否移动；③蛋白一边和胎盘一边是否界限分明，蛋白一边较亮，胎盘一边暗红色，如果胎盘一边发黑或苍白都表示胚蛋已死亡。
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用铅笔标明天然气室，鸡胚及大血管位置，然后在绒毛尿囊膜发育区避开大血管的地方作一记号，定为注射入口。绒毛尿囊膜区血管丰富，在照视时呈现红色，几乎占据鸡蛋的二分之一。
2. 用碘酒消毒注射入口和天然气室端的蛋壳，再用电动磨蛋器于注射入口和天然气室端的蛋壳上磨一小孔，勿伤及卵膜。
3．用大头针通过火焰消毒后刺穿气室端所开小孔的卵膜，这样可避免在注射时液体回流出来。
4．将鸡胚横卧于蛋架上，用无菌1毫升注射器抽取病毒液体，针头于卵壳成30°交角，～，～（图10-1）。
5．注射完结用胶布封口。封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。用过的注射器用煮沸法消毒，鸡胚放入35～37℃培养。
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6．注射后次日，逐日观察鸡胚生活情况，孵育48～72小时后移入4℃冰箱。注意鸡胚必须直立，令气室端朝上。
7．收获尿囊液之前取出鸡胚，用碘酒消毒气室端，并用镊子击破气室端卵壳，沿气室边缘小心打开一大缺口，然后用小镊子撕去卵膜及撕破绒毛尿囊膜，最后用毛细管吸取尿囊液，一般可吸得4～5毫升。
8．滴定尿囊液的病毒血凝效价。
尿囊接种法适用于某些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒、新城鸡瘟病毒等的培养，惟分离培养不如羊膜腔接种法阳性率高。
羊水
卵白
气室
卵黄囊
尿囊液
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图 10-1 鸡胚尿囊腔接种法
（二）绒毛尿囊膜上接种法（录像）
【材料】
牛痘苗病毒10－3稀释液、10～13日龄鸡胚、橡皮乳头、眼科镊子或小剪刀、无菌培养皿、无菌生理盐水，其余同《尿囊腔接种法》。
【方法】
1．选用10～13日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察是否活胚蛋，用铅笔划下绒毛尿囊膜发育的界限。
2．将胚蛋横卧于蛋座上，使其绒毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒绒毛尿囊膜部位和天然气室端的中心部，待干后即用磨蛋器轻轻在绒毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每边一厘米许），磨破卵壳而不使卵膜破裂，同时用磨蛋器于气室端开一小孔。注意：已磨好之鸡胚必须于1～2小时内接种，否则绒毛尿囊膜易与卵壳粘着。
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3．用分离针或大头针通过火焰消毒，穿通天然气室端所锯小孔；并用分离针或大头针轻轻划破卵壳，露出三角形卵膜，最好将分离针或大头针30°角度自上往下压迫卵膜一个小口，这样不致损伤绒毛尿囊膜。
4．立即用橡皮乳头在天然气室一端小孔吸气2～3次，目的将天然气室的空气吸去，而上面所开的洞口进入空气，形成一个人工气室，可在照蛋灯上照视一下，看天然气室是否消失，如未消失则尚需再吸气数次（图10-2）。
5．用小镊子通过火焰灭菌，稍待冷却后将三角形窗口的卵膜撕去、暂时盖以无菌培养皿防止污染，然后用消毒注射器吸取牛痘苗悬液（10－3稀释液，内加适量的链霉素及青霉素），揭去培养皿，～，注毕后窗口用胶布封口，封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰，烧去余碘。用过的注射器煮沸消毒。
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6．孵育于37℃温箱，每日观察生活情况，接种10－3稀释的牛痘苗后的鸡胚一般不死亡，但也可能在