实验10双缩脲法测定蛋白质含量ppt课件.ppt

实验十 双缩脲法测定蛋白质浓度
一、实验目的
1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法
2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法
（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析
维生素B12溶用、低浓度盐类不干扰测定。
含有核酸的样品：
蛋白质浓度(mg/ml)=×A280－×A260
总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；Micro -20μg/ml
快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便
经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量
不受样品中离子型和非离子型去污剂影响
检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN
+
Amax = 595nm
BLUE
Acid
Coomassie G-250
Protein - Dye
Complex
O
CH
2
CH
3
NH
C
CH
3
CH
3
N
CH
2
SO
3
-
CH
3
CH
2
N
CH
2
CH
2
CH
3
SO
3
Na
+
双缩脲法测定蛋白质*
双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围1-10mg
H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3
双缩脲
三、操作步骤
，按下表编号、加试剂
，,37oC反应30min。
，测定各管540nm光吸收值。
四、结果处理

以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。

根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg/mL），再根据样品的体积算出样品的浓度。
五、注意事项
1. 须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。
2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。
3. 比色杯的使用
微量表达法
10-3 (g, m, L) milligram 毫（克） mg
10-6 microgram 微（克） g
10-9 nanogram 纳（克） ng
10-12 picogram 皮 （克） pg
10-15 femtogram 飞（克） fg
10-18 attogram 阿、渺（克） ag
10-24 zepto（仄普托） 沙（克） zg
ppm: parts per million 1 g/ml 1ppm
ppb: parts per billion 1 ng/ml 1ppb
ppt: parts per trillion