免疫荧光三重标记具体方法及步骤.docx

免疫荧光三里标记具体方法及步骤
即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而 实现定位，定性，半定量的分析
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯H5min-二甲苯H15min-无水 乙醇I5min-无水乙免疫荧光三里标记具体方法及步骤
即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而 实现定位，定性，半定量的分析
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯H5min-二甲苯H15min-无水 乙醇I5min-无水乙醇H5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
2、 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（）的修复盒 中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中 应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（）中在脱 色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复条件根据组织来确定）
3、 画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）
4、 血清封闭在圈内滴加BSA孵育30mino （—抗若是山羊来源，则加兔 血清）
5、 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好 的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
6、 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃 动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标 记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
7、加CY3荧光增强剂：玻片置于PBS()中在脱色摇床上晃动洗涤3
次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育 ，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min
8、 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液()的修复盒 中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合 到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
9、 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放 于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
10、 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS()中在脱色摇床上晃 动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标 记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
11、 加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS()中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育 ，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min
12、 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液()的修复 盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结 合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
13、 加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放 于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
14、加CY5标记的荧光二抗：玻片置于PBS(