柳枝稷种子组培快繁技术.docx

柳枝稷种子组培快繁技术
 
 
杨冉+黄萍+祁珊珊+杨淞惠+杜道林
Reference：柳枝稷（Panicum virgatum L.）是一种理想的能源作物。以柳枝稷成熟种子为外植体，探索愈伤诱导过程中最佳外源激素配比， mg/L、 mg/L时，种子萌发时间延迟，接种后7 d才开始萌发，且萌发率仅为35%。由此可知，柳枝稷种子萌发的最佳培养基为MS+2，4-D 6 mg/L+6-BA mg/L+NAA mg/L。

经消毒处理的成熟种子培养5 d后，部分培养基上开始有愈伤组织形成，随后逐渐变大，并且随着愈伤组织的增大其表面逐渐变得干燥，质地紧密结实，颜色多为黄色、嫩绿色（图1-a）。当2，4-D浓度为2mg/L、6-BA浓度为
mg/L、 mg/L时，形成愈伤组织所需的时间最长，即培养12 d后才能观察到愈伤组织的形成。不同激素配比下，外植体愈伤组织的长势也有显著差别（图1-b）。在愈伤诱导培养基上培养25 d后，不同激素配比处理下愈伤组织在色泽、大小等指标方面差异较大，愈伤诱导率最高可达82%，最低仅为35%（表2）。一部分愈伤组织色泽淡黄，体积较小且表面干燥疏松；另一部分愈伤组织色泽嫩绿，体积较大且表面紧实，具有较强的再分化能力，可用于诱导成苗。这些生长状态良好的愈伤组织培养一段时间后体积逐渐增大，且伴随出现一些白色颗粒状胚状体。继续培养10 d后，有些原本白色的胚状体凸起，分化为嫩绿色的幼芽（图1-c）。随着培养时间的延长，新形成的幼芽逐渐变绿，并且直立生长，有的幼芽长势较快，接种到培养基上15 d后可长至2～3 cm。体积较小的愈伤组织接种一段时间后，分化出一些零星的幼芽，随后幼芽停止生长。将切割后的分化组织接种到新培养基上培养20 d，有的芽能长出长约4～6 cm的新叶，并从嫩绿色变成翠绿色（图1-d）。愈伤组织诱导及
分化的最佳培养基为MS+6 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA+ mg/L NAA+3% 蔗糖+% 琼脂，。

在愈伤组织诱导及分化的最佳培养基上培养40 d后，愈伤组织开始分化出大小不一的不定芽。选择长势较一致的不定芽切割后接种到含有不同浓度NAA的生根培养基上进行生根诱导（图1-e）。结果表明，当 NAA浓度为 mg/L 时，生根时间最短，7 d后即可观察到白色凸起并逐渐形成新根，生根率可达90%以上（表3），每棵再生苗均能诱导出 15～20 条新生根（图1-f）。当NAA浓度过低（ mg/L）或者过高（ mg/L）时，新根都会延迟出现。在生根的同时，新生苗新叶长势良好（图1-g），平均长约 10 cm，部分甚至高达20 cm（图1-g）。

当大部分新生苗长出数量不一的新根后，将组培瓶上的封口膜去掉，继续在培养箱中培养2～3 d，随后将培养基取出置于室温下培养，并在培养基表面加入少许无菌水，继续培养3 d后，将新苗从培养基中轻轻取出，避免损伤根部。用无菌水将幼苗表面的培养基冲洗干净，移栽至花盆中继续培养，用塑料薄膜覆盖以防止水分大量流失。每天用无菌水浇洒新苗，待新苗长势稳定后，将花盆搬至室外继续培养炼苗（图1-h）。当培养条件适合时，大部分幼苗都能正常存活，并且稳定生长（图1-i）。
3结论
Gupta等研究发现，2，4-D、TDZ结合使用对柳枝稷愈伤组织的形成起促进作用[6]。Denchev等认为，添加不同浓度的2，4-D及6-BA对柳枝稷的愈伤诱导、分化再生有明显影响[7]。传统的柳枝稷组培步骤较繁琐，包括愈伤诱导、继代、分化及生根等环节，耗时较长，且产率较低。许文志等利用柳枝稷成熟种子作为外植体进行愈伤组织的诱导及分化，研究灭菌处理及不同浓度激素组合对愈伤组织诱导及分化的影响，包括愈伤组织诱导、分化、生根等环节，耗时较长[8]。在愈伤诱导过程中，添加一定浓度的6-BA可改变愈伤组织的质量，提高植物分化再生频率[9]。有研究表明，2，4-D对愈伤组织形成有比较明显的促进作用，很少被植物细胞所代谢[10]，且不同浓度的 2，4-D与其他一些细胞分裂素结合，可以建立高效组培体系[11]。NAA是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂和扩大，诱导分化组织形成不定根[12]。本研究表明，不同浓度配比的激素愈伤诱导率差异较大，以MS培养基为基本培养基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、 mg/L NAA进行愈伤组织诱导，愈伤诱导率可高达82%。愈伤组织诱导增殖后，在最佳激素配比培养基上可直接进行分化培养，能进一