人类白细胞抗原,血小板抗原检测技术.ppt

人类白细胞抗原,血小板抗原检测技术
HLA抗原检测技术
人类白细胞抗原检测技术已广泛应用于器官移植前的组织配型
检测方法：血清学方法、细胞学方法和基因分型方法
与临床输血的关系—HLA抗原可引起免疫应答→HLA抗体→发热性非溶血
HLA抗体在所有病人中达到50%-90%，同时，也有17%-25%的HPA抗体出现，缩短输注血小板的寿命。
在黄种人中，HPA-2b是引起血小板输注无效的主要原因之一。治疗方法：输注"配合"的浓缩血小板。
观察血小板效果的指标
校正血小板计数增加值
（Corrected Count Increment, CCI）
计算公式
CCI=（输注后血小板计数-输注前血小板计数）×体表面积/输注血小板总数×1011
诊断标准
输注血小板后1小时CCI低于10×109/×109/L
引起血小板输注无效的原因
非免疫学原因
免疫学原因
非免疫学原因
脾功能亢进
感染
发热
药物作用
DIC
血小板的质量问题
免疫学原因
人类白细胞抗原(HLA)
血小板特异性抗原(HPA)
如检测到患者血清中含有HLA抗体或HPA抗体,即可判断病人的无效输注是由于同种免疫引起 的
今后避免输入相应的抗原
其他临床应用
二、输血后紫癜
多发生在女性，有输血和妊娠史
三、新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜
与新生儿溶血病的发病机制相似
四、特发性血小板性紫癜
血小板血型检测技术
血小板血型（包括血小板抗原及对应抗体），在临床医学和输血实践中具有重要意义，利用可能的方法检测血小板抗体，可以提高血小板输注的安全性和有效性。
血清学检测
血小板免疫荧光试验（PIFT）：既可用于血小板抗原鉴定，又可以用于血小板抗体检测和交叉试验
1、血小板抗原鉴定：待测血小板用于聚甲醛（PFA）或氯喹预处理，处理过的血小板 与已知的特异性抗血清孵育，洗涤，再与标记了异硫氰酸荧光素的抗人球蛋白孵育，再次洗涤并在荧光显微镜下进行观察。
血小板抗体检测和交叉试验
利用已知抗原特异性的血小板细胞谱与待检血清混合反应，其余步骤与血小板抗原鉴定类似，最后根据血清血小板细胞谱的反应情况，来鉴定血清中抗体的特异性。
PIFT的优点
①因为在显微镜下只观察荧光标记的血小板，所以可以避免由于细胞碎片等引起的非特异性反应。
②多特异性的抗球蛋白可以识别
流式细胞术
流式细胞术(FCM)1986年,Rosenfeld等发明了此技术。该法将待测血清和荧光标记的已知型别的血小板抗体孵育后，用流式细胞仪检测。FCM用于免疫性血小板减少症患者的血小板相关抗体及血小板膜糖蛋白检测,具有灵敏、快速、简便的特点,是适用于临床诊断的新方法。
单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：该法先制备羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体的血小板共同孵育，再将孵育后的复合物加入多孔板，孵育，洗涤，最后加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。
特点
此方法敏感度高、特异性强，即使是血小板上抗原数量很少的HPA-5抗原，也能检测出。MAIPA方法可灵敏地检测血小板特异性抗体。
简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA）：该法以抗人IgG抗体致敏红细胞为指示细胞，直接指示固相血小板抗原抗体免疫反应，检测血小板抗体。若血小板上存在抗体，则指示细胞呈扩散分布，为阳性；若无抗体，则指示细胞聚集在底部，呈扣状，为阴性。
特点
该方法操作简单，微量，重复性、特异性和敏感性均较理想，固相化的血小板及抗IgG指示细胞能长久保存备用，可开展大量样本的检测工作。
基因分型方法
（PCR-SSP）的原理：
设计特异性引物，利用引物3'端的特异性，直接扩增相应的HPA片段，PCR产物凝胶电泳以后，以紫外线透射来检测，DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。
特点
SSP-PCR操作比较简单，耗时较少，适合小批量标本，是目前HPA基因定型中最常用的一种技术。

实时定量PCR原理：在PCR指数扩增期间，利用连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。这一方法成功运用于HPA-1、-2和-3基因定型。
特点
它广泛应用于定量检测mRAN表达水平，其特点是易操作、高通量、敏感性高和特异性强。
基因芯片技术（DNAmicroarray）
基因芯片技术利用正向杂交的方法，制成针对HPA基因SNP位点的DNA芯片；用荧光标记的HPA型特异性探针分别与芯片进行杂交，用软件分析样品的杂交结果，从而确定样品的HPA基因型。此技术特点是一次性可同时检测大量样品，快速，准确。
限制性片段长