突变体质粒构建—PCR法.docx

实验题目：突变体质粒构建一一PCR法
背景与原理：
蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技 术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR方法可向目的DNA片段中引入任何 所需的变化，包括碱基的添rpm， 1min。
酶切体系：
构建质粒酶切体系：
酶切片段
酶切载体
片段
0卩1
质粒
0卩1
BamHI
.5卩1
BamHI
.5卩1
XhoI
.5卩1
XhoI
.5卩1
10xK
10xK
卩1
卩1
水
水
1卩1
9卩1
酶切验证体系：
酶切体系I
酶切体系II
质粒
1
质粒
1〜
〜

BamHI
0.
XhoI
25卩1
0.
EcoRI

25卩1
10xK
l
1卩
10xH
1卩1
水
补
水
补
足至10p1
足至10p,l
连接体系：
载体（100ng）
卩1
片段（ 68ng）
卩1
T4 连接酶

10xbuffer
1卩1
水
补足至10卩1
制备感受态：
取培养的菌液lml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD600=（可凭经验）；
将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml；
离心，4°C 4000rpm, 10min；
弃上清， CaCl2，重悬沉淀；
离心， 4C 4000rpm， 10min；
弃上清， CaCl2，重悬沉淀，再分别加入2ml 灭过菌的 40％甘油，混合均匀；
按每管150卩1分装，-80C贮存备用。
转化：
超净工作台内，将连接体质粒加入感受态细胞，冰浴30min；
热击， 42C， 90 秒；
冰浴1〜2min；
超净工作台内，加入800卩1 LB液体培养基，振荡预培养50min；
离心，8000 rpm， ,弃上清，余100卩1左右，吹散沉淀；
涂布LB固体培养基平板，37C正置培养1h；
g. 翻转平板倒置培养过夜。
小提质粒：
离心收集菌体，12000rpm, 30S；
弃上清，150卩1 溶液 I (25mM Tris-Cl, 10mM EDTA)重悬菌体；
加入150卩1溶液II (2%SDS： NaOH = 1： 1)轻混；注：溶液II现用现配。
加入150卩1溶液III轻混；
乙酸钾(5M) 60ml
冰乙酸
水
离心， 12000rpm， 5min；
收集上清至新管，加入等体积酚：氯仿(1： 1)，振荡；
离心， 12000rpm， 5min；
移上清至新管，二倍体积无水乙醇沉淀20min；
离心， 12000rpm， 10min；
弃上清，室温干燥，20卩1 TER溶解；
电泳验证。
日程安排：
第一组
第二组
周