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血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
刘晓如
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【实验目的】
、凝胶层析和离子交换层析分离纯化蛋白质的基本原理及应用


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【实验方法】
一、盐析法粗分γ-球蛋白
二、凝胶过滤方法脱盐
三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白
四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度
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【基本原理】
蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。
不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下,带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别,可分离纯化各种蛋白质。
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分离蛋白质的方法
分离方法
沉淀法
盐析法
有机溶剂沉淀法
层析法
电学法
电泳法
等电聚焦
超速离心法
离子交换层析
吸附层析
凝胶过滤(分子筛)
亲和层析
在分离纯化时,根据情况选用几种方法,相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
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【基本原理】
本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法,分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。
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实验思路
分段盐析去除杂蛋白
凝胶层析脱盐
交联葡聚糖吸水浓缩
醋酸纤维素薄膜电泳鉴定
先粗后细
离子交换层析纯化
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一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白
盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度不同,分别析出,达到彼此分离的方法。
本实验在半饱和硫酸铵溶液中,清蛋白溶解,球蛋白将沉淀析出,经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。
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定义:加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。
原理: 破坏蛋白质两个稳定因素:
水化膜和电荷层
中性盐:(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。
优点:蛋白质不变性,常用。
盐析法
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盐析步骤
取离心管一支加入血清 2ml
加入2ml %氯化钠摇匀
边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml
上清液(主要含清蛋白)倾去
静置10min,再离心(5000转/分)10min
沉淀用1ml %氯化钠搅拌溶解
逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀
静置10min,再离心(5000转/分)10min
倾弃上清液(主要含α、β球蛋白)
沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白
(pH=)1ml溶解
γ-球蛋白
粗提液
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