非洲猪瘟检疫技术规范.docx

非洲猪瘟(Africanswinefever，简称ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病其特征为病程短，病死率高，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。为世界r（标准DNAMarker）。和10倍浓度的聚合酶链反应（PCR）扩增缓冲液。
.5自动DNA热循环仪。
操作方法
・75mL的离心管中：灭菌蒸馏水（）；10倍浓度的PCR扩增缓冲液（5VL）;1・25mmol/LdNTP贮存液（8pL）;引物1（1pL）;引物2（1pL）;样品DNA溶液（10JAI）（见附录A）;TaqDNA聚合酶（。.5PI）。
222设定两个对照，阳性对照为标准的ASFV-BA,株的10pLDNA含量为10fg;阴性对照为不含
DNA的灭菌蒸馏水10讨。
。
，按下述程序和条件进行
DNA扩增94C5min,50一C2min,72C3mii循环一次;94C1min,50'C'2min,72C3min循环30次；
94C1min,50"C2min,72'C10min循环一次，最后置于4'C保存。
，从矿物油下小心取出每种反应混合物20pL,放人另一支干净的Eppendorf
管中并加2pL载样缓冲液。
%琼脂凝胶（见
附录B1）板的各孔中，其中一孔加标准阳性
DNA样品。在凝胶的边孔中加人标准分子量DNA
Marker,

:用紫外光源检查凝胶。如为阳性样品，则出现一条孤立的、与阳性对照PCR产物的同步迁移的带，分子量为265bp,阴性对照和非ASF感染猪无265by带。
3酶联免疫吸附试验（ELISA）
3门试剂:标准抗原
中华人民共和国国家质t监督检验检疫总局2002-02-19批准20D2—05—01实施
Gs/'r18648-2002
;.;0・1mol/L磷酸盐缓冲液（制备方法见附录Cl），底物溶液（见附录C2）,
操作方法
，每孔加人用dmol/LpH7.
2磷酸盐缓冲液稀释至工作滴度的抗原溶
液50pL，封板后于4C作用16h（过夜）
3・3・，每次2min,
3・3・3用含。.05Y,吐温一20的。.1mol/I磷酸盐缓冲液溶液，将待检血清以及阳性和阴性对照血清作30倍稀释，将稀释的血清加人用抗原包被的孔中，每孔中加50川J。
，37C作用30min,
然后用。.1mol/L磷酸盐缓冲液洗3次
%吐温一20的。.1moll,磷酸盐缓冲液配制的免疫球蛋白G(IgG)
抗猪过氧化物酶结合物溶液
，37°C作用于1h，然后用。.1mol/I磷酸盐缓冲液洗3次
—底物溶液。
,
119每孔加50pL,