《蛋白质的结构》 (2).ppt

二、蛋白质的结构
蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链结合而成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。（20种aa的平均分子量为110）
蛋白质分子量变化范围很大, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-
Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽
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L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val
 
L-Orn L-Orn
 
L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 
短杆菌肽S(环十肽)
 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。
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习题：
等电点计算：
有一个蛋白质拥有30个侧链羧基（pKa ），10个咪唑基团（pKa ），15个 ε-氨基（pKa ）。
求该蛋白质的等电点。
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2 蛋白质的一级结构
蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。
多肽链的氨基酸顺序。
多肽链内或链间二硫键的数目和位置。
其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。
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蛋白质一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。
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1 样品必需纯（>97%以上）；
2 知道蛋白质的分子量；
3 知道蛋白质由几个亚基组成；
4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。
5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
测定蛋白质的一级结构的要求
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蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定
(1)、肽链的拆开和分离
(2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目
(3)、二硫键的断裂
(4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比
(5)、N端、C端的测定
(6)、多肽链断裂
(7)、测定每个肽段的氨基酸顺序。
(8)、确定肽段在多肽链中的次序。
(9)、确定原多肽链中二硫键的位置。
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酸水解
常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。
此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；
含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。
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碱水解
一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。
由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。
部分的水解产物发生消旋化。
该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。
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酶水解
目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。
应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。
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测定步骤
(1) 多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。
蛋白质一级结构的测定
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测定步骤
几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
蛋白质一级结构的测定
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测定步骤
(2) 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
蛋白质一级结构的测定
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测定步骤
(3) 二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
蛋白质一级结构的测定
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二硫键的切割与保护
1、过甲酸〔performic acid〕 不可逆