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蛋白质结构分析
第三节 蛋白水解酶酶解
一、 常用蛋白水解酶
(1)胰蛋白酶(trypsin)
专一作用在Arg和Lys(碱性氨基酸)的羧基端，但对Arg-Pro和Lys-Pro
键没作用。
我比为1:10至1:20(质
量比)；对亚微克级样品，酶与底物之比高达2:1。酶解后-20℃保存或
立刻用数微升10％TFA酸化，上样到HPLC柱上分析。
(6)限制性酶解
限制性酶解有助于蛋白质测序时的序列演绎。最著名的例
子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草杆菌蛋白水解酶在pH
，活性没有变化，但出现一个新的N端丝氨酸。用
AmberliteIRC-50离子交换柱，
钠缓冲液可分离到一个大片段(S蛋白)和一个小片段(S肽)。
也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是S蛋白，上层
液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。
第四节 蛋白质中存在着封闭的N端
有些蛋白质的N端是封闭的，尤其在腹水细胞中，80％的蛋白质的N
端是乙酰化的，因此用Edman法不能直接测定其序列，要用一系列的化
学或酶处理。
如果在蛋白质/肽序列仪上测定不到序列，蛋白质的量肯定又是足够
的，则可在仪器上进一步用含水TFA(三氟乙酸)处理样品，使蛋白质酸
水解成许多肽段后再测序，这时会有很多PTH-氨基酸出现，以此反证此
蛋白质的N端是封闭着的，再用下述方法除去封闭着的N端。
首先，用温和的酸处理可以除去甲酰化的甲硫氨酸(f-Met)，也可能
引起丝氨酸、苏氨酸的乙酰化N-O重排反应。如果酸处理后还是测不到
序列，则进一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白质N端上的焦谷酰基；假设
这一方法仍不见效，再用较强的酸处理或其他酶处理。虽然有乙酰氨基
酸释放酶(acylaminoacid-releasing enzyme，AARE)，但它不能作
用长度在20个氨基酸残基以上的蛋白质或肽。因此，封闭的蛋白质首先
裂解成小肽，再用AARE处理除去N端上的乙酰化氨基酸转变成n-1肽，
然后n-1肽的序列再用Edman法测定。
一、除去蛋白质中封闭的N-乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸
，加无水TFA，密闭，40℃保温
1h，然后打开管盖，让TFA挥发，干燥，再进行序列分析。
二、除去N-甲酰甲硫氨酸
，加30µl HCl，密闭，
25℃水解24h，打开管盖，真空除去HCl，然后进行序列分析。
以上两种温和酸水解除去甲酰或乙酰氨基酸，这与时间、温度、酶浓
度有很大关系，过分的酸水解会引起蛋白质中肽键的断裂，如对酸不稳
定的Asp-Pro键；相反，条件不够，则封闭的N端基团水解不完全，导
致测序的起始点不均一。
三、除去N端的焦谷氨酸残基(pyroglutamate)
样品在序列仪上测不出N端，
烯微量离心管中，％PVP-40洗膜片(见上节原位酶解部分)，再加
100µl焦谷氨酸氨肽酶(5µg于50mmol/，含10mmol/L
DTT)37℃酶解5～10h，用水洗膜，干燥，放回序列仪分析。
五、选择性纯化N端封闭的肽
蛋白质用胃蛋白酶(pepsin)或嗜热菌蛋白酶(thermolysin)作用后
(但不能用胰蛋白酶!)，酸化到pH2，上强酸性阳离子交换柱(例Dowex
50mmX2mm，H+型)。所有含游离氨基或其他碱性基团的肽都结合至
柱上，仅缺少碱性基团的肽通过柱泄出。如果N端是封闭着的(没有游离
的N端氨基)，同时因用专一性很广的酶作用，肽较小又不含组氨酸、赖
氨酸、精氨酸则可在排出液中发现N端封闭的肽。
此技术的局限性是：大肽(甚至含有碱性基团)可能不结合到树脂上，
因为它们不渗入树脂孔径内；相反，一些疏水的肽，特别含有色氨酸残
基，即是它们缺少游离的N端氨基，也可能结合到柱上。此外，如果存
在碱性基团非常靠近N端，胃蛋白酶作用不能除去，则该技术也不见
效。
应该指出，N端为谷氨酸的肽在极端pH下会环化而转变成封闭，需加
以小心。近年来，由于质谱(MS)在生物样品检测中有了长足的发展，可
用MS精确测定分子质量的方法来判断封闭的N端为何种基团。
第五节 蛋白质中的C端残基的测定
一、羧肽酶法
羧肽酶是最常用的方法，对一些小肽而言，C端有时最容易测定的，
如胰蛋白酶酶解肽段时总是以Lys或Arg为C端；BrCN裂解的肽总是以
高丝氨酸(homoserlne)为C端；V8蛋白酶酶解的肽总以