高效液相色谱法(11).ppt

高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
HPLC
第十一章
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主要内容
11-1 概述
11-2 基本理论
11-3 高效液相色谱分离方法
11-4 合相色谱法分类
 反相键合相色谱:
常用固定相：C18
分离对象
非极性
中等极性化合物
常用流动相
甲醇-水
乙腈-水
反相键合相色谱
疏溶剂分离机制
固定相极性<流动相极性
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 正相键合相色谱
固定相极性 > 流动相极性
离子性键合相色谱
将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。
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例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水
出峰顺序：苯酚，甲苯
出峰顺序：甲苯，苯酚
十八烷基键合相
二醇基键合相
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保留时间：
<
例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。
没食子酸
3,4-二羟基苯甲酸
固定相: 非极性 流动相: 极性
组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸<没食子酸
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五、尺寸排阻(凝胶)色谱法SEC、GPC
相对分子质量差别
大于10％的化合物
才可以分离
1. 分离原理
（Size-Exclusion Chromatography）
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是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。
凝胶

不采用改变流动相组成的
方法控制分离度
凝胶色谱主要分离高分子化合物，常用流动相：
四氢呋喃、甲苯、二氯甲苯、二氯乙烷、氯仿、丙酮等；
分离生物物质时主要用水、缓冲液、乙醇、丙酮等。
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★ 分离方法的选择
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§11-4 高效液相色谱仪
Waters UPLC 超高效液相色谱仪
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高压泵
流动相溶剂
废液
色谱柱
进样口
检测器
高压输液系统 + 进样系统 + 分离系统 + 检测系统
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一、高压输液系统

要求：
输出压力高
平稳、脉冲小
流量稳定可调
耐腐蚀
LC最重要的部件
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低压梯度（外梯度）
高压梯度 （内梯度）
通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。
梯度洗脱
①改善分离
②缩短分离时间
泵增压 混合
混合 泵输入
按比例
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等度洗脱与梯度洗脱
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梯度洗脱的特点
 改善分离, 加快分析速度；
 改善峰形, 减少拖尾;
 可能引起基线漂移
梯度洗脱适用于：
分配比变化范围宽的复杂样品
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1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。
2) 适用于所选择的检测器。
3) 化学惰性好，以免破坏固定相。
4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。
5) 纯度高，溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。
对流动相溶剂的一般要求
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二、进样系统
准备状态 进样状态
六通阀进样装置
 自动进样器
直接进样
进样阀
自动进样器
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三、色谱柱
内径：1～6 mm，柱长：5～30 cm；
柱填料粒径：≤ 5µm
分离柱
色谱仪心脏
◆ 预柱（保护柱、前置柱）
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四、检测系统
(ultraviolet photometric detector)
(b) 可变波长紫外检测器
(c) 二极管阵列检测器
(a) 固定波长紫外检测器
通用型
选择型
氘灯190-600nm
光栅
流通池
测量光电二极管
参比光电二极管
分束器
聚焦
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两种检测器的色谱图
(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器
(b)
(a)
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灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱、色谱峰的识别和纯度分析。
不能分析紫外没有吸收的化合物。流动相选择有限制。
一些常用溶剂的紫外截止波长
溶剂
CS2
氯仿
四氢呋喃
苯
乙腈
甲醇
水
紫外截止波长/nm
380
245
212
210
190
205
187
紫外检测器特点
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(fluorescencl detector)
灵敏度高，比UV