蛋白质的结构与功能-蛋白质iv.ppt

蛋白质的性质及研究方法
肌红蛋白晶体
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蛋白质的理化性质
紫外吸收:最大吸收峰为280nm
两性解离:蛋白质的pI值不能直接计算,只能使用等电聚焦等方法进行测定
胶体性质
沉淀反应:盐析、pI沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金蛋白质的性质及研究方法
肌红蛋白晶体
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蛋白质的理化性质
紫外吸收:最大吸收峰为280nm
两性解离:蛋白质的pI值不能直接计算,只能使用等电聚焦等方法进行测定
胶体性质
沉淀反应:盐析、pI沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀
变性、复性
水解
颜色反应
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蛋白质变性
蛋白质受到某些理化因素的作用,其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。
导致蛋白质变性的物理因素有:加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射;化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。
蛋白质变性以后,其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。主要的变化包括:(1)溶解度降低。(2)粘度增加。(3)生物活性丧失。(4)更容易被水解。(5)结晶行为发生变化。
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蛋白质的水解
蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。但需要注意的是,酸水解会破坏几种氨基酸,特别是Trp几乎全部被破坏,其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下,容易水解成Glu和Asp。酸水解常用硫酸或盐酸,使用最广泛的是盐酸;碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏,并且产生消旋现象,但不会破坏Trp;酶水解效率高、不产生消旋作用,也不破坏氨基酸,但由于不同的蛋白酶对肽键特异性不一样,因此,由一种酶水解获得的通常是蛋白质的部分水解产物。
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四种羧肽酶来源和特异性
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几种蛋白酶特异性的比较
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反应名称
反应试剂
颜色
用处
双缩脲反应
硫酸铜,碱性溶液
紫红色(540nm)
定量测定蛋白质
黄色反应
硝酸
先产生白色沉淀,加热变黄,再加碱呈橙黄色
鉴定含有芳香族氨基酸的蛋白质
米伦氏反应
硝酸、硝酸汞、亚硝酸、亚硝酸汞混和液
先是白色沉淀,加热后变成红色
鉴定含有Tyr残基的蛋白质
乙醛酸反应
乙醛酸、浓硫酸
紫色环
鉴定含有Trp残基的蛋白质
坂口反应
次氯酸钠、α-萘酚、氢氧化钠
红色
鉴定含有Arg的蛋白质
福林反应
磷钼酸、磷钨酸
蓝色
Lowry法鉴定含有Tyr残基的蛋白质
醋酸铅反应
醋酸铅
黑色
含有Cys的蛋白质
考马斯亮蓝结合反应
考马斯亮蓝G-250酸性溶液
蓝色
Bradford法定量测定蛋白质
蛋白质的各种颜色反应
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蛋白质研究方法
假定你发现一种新的蛋白质:蛋白质X
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蛋白质的分离、纯化技术
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(SDS-PAGE)
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(等电聚焦)
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(Western印迹)
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(序列分析)
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X-射线衍射和核磁共振
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蛋白质纯化
一、准备工作
要解决三个问题:
(1)纯化蛋白质的目的;(2)目标蛋白的测活方法;(3)纯化蛋白质的原料。
二、纯化步骤:
(1)破碎细胞或组织(混合和匀浆);(2)去除残渣(离心);
(3)沉淀/浓缩(硫酸铵或聚乙二醇);(4)纯化(层析);
(5)鉴定
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等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质,以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度,处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移,最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦,不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离,而且还可以测定出各种蛋白质的pI
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蛋白质的双向电泳
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Western印迹
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蛋白质一级结构的测定
直接测定法
间接测定法。
先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列,然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。
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测定步骤
主要试剂和方法
备注
1
详见蛋白质的纯化
2
极端pH;8mol/L尿素;
6mol/L盐酸胍;高盐(常用硫酸氨)。
如果肽链之间以二硫键相连,可使用步骤3的方法进行拆分。
3
过甲酸氧化法;
巯基类还原剂还原法:巯基乙醇;二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖醇。
第二种方法需要使用烷基化试剂,如碘代乙酸,防止二硫键从新形成。
4
氨基酸自动分析仪
为步骤6和7选择合适的裂解法提供有用的信息。
5
N-端测定:Sanger试剂法;丹磺酰氯法;PTIC或其衍生物测定法。
C-端测定:肼解法;还原法:使用硼氢化