纤维素酶分离纯化方案.docx

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纤维素酶的分离及纯化方案
纤维毒酶已广泛应用于食品、医药、饲料和纺织等领域。
纤维素酶来源广泛、组分复杂,各组分的分子量和等电点相差很小,分离纯化工作比较困难;而纤维素酶的分纯工作非常重要,只有得到纯酶,才能了解其组成、性质及相互关系,并可根据纤维素酶的不同理化性质纤维材料的作用特点,开展纤维素降解机制的研究,为纤维素酶分子结构研究、酶基因克隆、新酶分子的构建和DNA体外定点诱变等提供依据。
材料
粗酶液:取菌种发酵液于 4℃,8000rpm,离心15分钟,收集上清液即为粗酶
液。
纤维素酶分离纯化材料与介质透析超滤材料:10,000NMWL透析袋;分离纯化介质:SephadexG-100;SephadexG-75;SephadexG-50
主要仪器:柱层析系统;DYY-2稳压稳流电泳仪;DYY-m24D型电泳槽;层析柱50cm×;紫外检测仪;记录仪;分步收集器;高速冷冻离心机;全温震荡培养箱。
方法
纤维素酶活力测定方法:3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的
3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原,生成棕红色的氨基化合物,在 540nm波长处有
最大光吸收,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系,利用
比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
蛋白质含量测定:采用Bradford法测定蛋白质含量,以牛血清白蛋白(B
SA)做标准曲线 。
采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliantblue ,G250,简称CBB—G250)
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作为染色物质。依其存在形式不同可表现为红色和蓝色,当 CBB—G250单独存在
时为红色;当其与蛋白质结合后,其颜色变为蓝色。蓝色的深浅与溶液中的蛋
白质含量(0~1000μg/mL)成正比,故可用于测定蛋白质含量。
纤维素酶的分离纯化方法
粗酶液的制备: 取发酵液于4℃,8000rpm, 离心15分钟, 收集上
清夜即为粗酶液。测定粗酶液中纤维素酶活 , 蛋白质含量。
硫酸铵沉淀和透析: 取粗酶液, 加入硫酸铵至25%饱和
度,4℃,10000rpm,离心10分钟,分别测沉淀物和上清液中的酶活,酶活集中于沉淀物中,收集沉淀物溶于少量mol/LPh磷酸缓冲液中,透析除盐,
得到经硫酸铵沉淀的纯化酶液 , 此为分子筛柱层析上样样品。
纤维素酶的分离纯化方法
葡聚糖凝胶层析 葡聚糖凝胶SephadexG-100;SephadexG-75;
SephadexG-50,充分溶胀, 抽气, 分别装柱(50cm×, 用mol/ LpH磷酸
缓冲液充分平衡后上样, 选择合适的流速、检验器灵敏度,测定出现吸收峰各
管的纤维素酶活及蛋白含量。根据不同凝胶的层析图谱判定最适的一种。
-SPGE采用垂直板式不连续系统电泳,分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%,用%(W/V)考马斯亮蓝R-250酸性乙醇水染色。
说明:
凝胶过滤层析条件温和、简便、分离范围广、回收率高,对生化物质的分离十分适宜。
由于酶易失活,故分离纯化工作于4℃下进行,实验中用到的各溶液、器皿均应先预冷。
加硫酸铵时要慢,同时搅拌,防止局部盐浓度过高。搅拌速度也不要太快,防止蛋白质表面变性。
装柱时,胶悬桨不要太稀也不要太稠,太稠易带入气泡,太稀则需分次才能装完。
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上样和换层析液时,要保持床面平整,同时床面不能流干。
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