KDR siRNA表达载体的构建和鉴定.doc

KDR siRNA表达载体的构建和鉴定.docKDR siRNA表达载体的构建和鉴定
R. pSilencer : 5′AATAATCAGAGTGGCAGTG3′,反义链: 5′ACATCA3′,产物长度506 bp;pSilencer : 5′GTCAAGGG3′,反义链: 5′TTCAAAGGGAGGCGAGCA3′,产物长度383 bp; pSilencer : 5′ACGGACAGTGGTATGGTT3′,反义链: 5′CGAGTCAGGCTGGAGAAT3′,产物长度279 bp. 内参照βactin, PCR引物正义链: 5′GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3′,反义链: 5′CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′,产物长度353 bp. PCR产物经琼脂糖电泳后于FR200图像分析系统分析.
重组质粒的构建及鉴定酶切后的琼脂糖电泳图可见一大小为66 bp左右的酶切片断,与设计合成的KDR基因特异性序列大小相符(图1). 将各重组质粒分别命名为pSilencer , pSilencer , pSilencer ,阴性对照质粒命名为pSilencer (negative control). DNA序列测定结果表明, neo载体(图2).
M: DNA marker; 1: ; 2: ; 3: ; 4: .
(略)
h,经荧光倒置显微镜下观察pEGFPN2质粒同步转染的PC3,结果显示,此次转染的效率约为60%~70%.
, pSilencer ,提取各组细胞总RNA 经RTPCR扩增KDR片段,琼脂糖凝胶电泳结果(图3)显示,pSilencer , mRNA水平较亲本细胞和阴性质粒转染细胞明显下调,抑制率约为55%.
A: ; B: ; C: .
(略)
M: DNA marker; A1: ; A2: ; A3: PC3;A4~A6: βactin; B1: ; B2: