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摘要方法幽门螺杆菌,畃是一种专寄生于人胃黏膜的革兰阴性微需氧菌,世界上至少有%,而且是胃癌、初级馨土觥⒂不胆管炎等疾病的重要因素。畃母腥竞头⒉∩⋯一粘膜接触诱导因子,是独立于和之外的一个重要毒力相关基因,由,虮嗦耄╥、街值任换颉8没蚩赡芡ü调控相关毒素基因的表达等机制,参与的致病作用。有研究发现,。虽然国内外研究人员针对基因与畃所致临床疾病的相关性进行了大量研究,认为基因╥和基因锹晕秆缀褪赋Q裉匾煨韵喙鼗颍且恢钟胙字⒑兔庖咚鹕有关的毒力因子。但是基因生物学功能及其致病机制仍不十分清楚。研究首先利用郑州市慢性萎缩性胃炎患者幽门螺杆菌临床分离株,对基因进行了克隆和序列分子特征分析;又根据同源重组原理,利用分子生物学方法进行基因的插入失活突变,构建了基因的突变株;然后进一步比较遗传背景相同的野生株和构建的基因突变株的重要特性,包括菌株的尿素酶活性、与细胞体外共培养时对胃粘膜上皮细胞的形态特征、细胞周期、增殖、凋亡等特性的影响;比较野生株和突变株对细胞的黏附性以及诱导细胞产生炎性细胞因子一芰Φ妊字⑾喙匾素。为阐明基因的功能及参与致病的分子机制奠定了重要的实验基础。拿怕莞司甑呐嘌盎蜃镈的制备将临床分离株又钟诓际掀桨迳希微需氧条件下培养。后收获细菌,提取基因组摘要瓾.
基因的克隆引物设计及┰参牛瓽公布的畃甑膇蚣捌渖舷掠魏塑账嵝蛄猩杓埔物,用于扩增包括基因在内的基因序列,扩增片段长度约基因克隆与测序锘厥沾炕笥雙一靥辶硬⒆;蟪Ω司鶧秆『重组质粒的阳性克隆,测序并分析。,用软件对检索到的基因序列进行多重序列比较,应用等软件对基因及相应氨基酸序列进行同源比较,并构建系统发生树进行分析。虼虬性靥宓墓菇将重组质粒籘爸柿分别酶切并连接,构建重组质粒猧将重组质粒甶涂敲顾乜剐曰蚶┰霾锩盖胁⒘樱菇ǔ龃卡那霉素抗性标记的突变打靶载体甶甼基因突变株的构建与鉴定采用电穿孔方法将打靶载体猧甼缱;胧芴寰暌吧虷中,在普通布氏平板上培养缓笞M坑诤敲顾夭际掀桨迳霞绦嘌~,筛选出基因突变株,经安庑蚪屑ā吧旰蚷蛲槐渲晏匦员冉采用尿素酶活性诊断试剂,检测和比较野生株和插入失活突变株的尿素酶活性差异。将细菌与赴餐嘌欢ㄊ奔洌鄄旌捅冉舷赴翁П浠采用壬ǚǎ觳庖吧闔虷插入失活突变株对摘要。
赴鲋郴钚缘挠跋觳⒎治霰冉稀流式细胞仪检测野生株、突变株与赴才嘌欢ㄊ奔浜笙赴期的改变并分析比较。凋亡率并分析比较。⒎治觥野生株与突变株对胃粘膜上皮细胞的黏附作用分析野生株与突变株分别与细胞共培养一定时间,用免疫学方法处理,在荧光倒置显微镜下观察,流式细胞仪检测并分析其粘附率。±硎荆阶橹涞比较采用煅椋欢嘧橹涞谋冉希葑柿咸氐惴直鸩捎玫ヒ蛩胤讲罘治龌蛑复测量的方差分析;两两比较采用最小显著差法煅樗既.。拿怕莞司掷胫闙蚩寺〖胺治成功克隆幽门螺杆菌菌株基因序列,扩增产物大小约为重组质粒ッ盖胁片段,双酶切产生的銎危籋基因与大多数美国来源菌株同源性较高,均大于%,与日本、印度等地区来源菌株同源性小于%;基因一区位于起始密码子嫌蔚Γ鹗济苈胱由嫌我处有一个序列,起始密码子和上游基因之间有两个拇?芍馗葱蛄校渌厍掷菌株与基因特征有差异。摘要和;畃幺:口;。
蛲槐渲甑墓菇采用基因重组的方法将卡那霉素抗性基因插入目的基因序列中,构建了突变打靶载体甶猭煌ü绱┛鬃;椒ń槐湓靥遄;胍吧辏选出基因突变株。用基因两端序列设