项目十九 吞噬细胞功能检测.docx

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一、中性粒细胞吞噬功能测定
(Neutrophilphagocytosisassay)
(一)吞噬试验
【实验原理】中性粒细胞具有吞噬功能,当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合孵育一定时间后,颗粒物质被吞噬。根据吞噬率和吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。
【试剂和器材】
试剂20%FCSRPMI-1640培养液、、Wright染液、金黄色葡萄球菌培养物、抗凝剂(4g/L柠檬酸钠溶液)。
器材37°C温箱、显微镜、滴管、一次性采血针、微量细胞培养板、无菌干棉球、酒精棉球、碘酒棉球、接种环等。
【步骤和方法】
热灭活葡萄球菌悬液配制取金葡菌24h琼脂斜面培养物,用无菌生理盐水洗下菌苔,用PBS洗涤2次,100C加热15min灭活。取热灭活金黄色葡萄球菌混悬于20%FCSRPMI-1640培养液中,用比浊法调整浓度至6x107/mlo4C保存,备用。
于微量细胞培养板孔内加1滴(约50卩1)抗凝剂,无菌采人末梢血2滴(约100卩1)与抗凝剂混匀。
向孔内加6x107/ml金黄色葡萄球菌悬液2滴(约100卩1),混匀。
置37C烛缸或5%CO2孵箱内培养30mino
取1滴培养液推片,自然干燥,Wright染色,水洗,干燥,油镜镜检。【结果判定】
计数200个中性粒细胞,并分别记下吞噬细菌的细胞数和各个细胞吞入的细菌数。计算吞噬率和吞噬指数:
100%
吞噬率=200个中性粒细胞中吞噬细菌的中性粒细胞数巫’ 2oo
吞噬指数=200个中性粒细胞吞噬的细菌总数巫曰— 200
【注意事项】
所用器材要洁净。
越接近片子末梢细胞数越多,计数时应取片子前、中、后三段计数,以提高准确性。
抗凝剂用量要适当,过高则抑制吞噬功能,过低使血液凝固。
【方法评价】
此法易操作、不需特殊设备,省时,费用低廉。结果直观,可用于评价其他方法获得的结果,但是光学显微镜分辨率低,有时难以计数吞入的细菌颗粒。
【临床意义】
本试验可用于检测有吞噬功能障碍的病症,如结合NBT试验,在一定程度上可反映机体的免疫功能状态,也可用于有免疫调节活性药物的筛选。
【思考题】
简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理及临床意义。
此法在操作过程中应注意哪些事项?
(二)硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验
【实验原理】细菌感染时,中性粒细胞糖分解代谢活性增强,糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬的或渗透到中性粒细胞胞浆内的NBT(nitrobluetetrazolium)染料接受,使淡黄色的NBT还原成蓝黑色的甲(formazan),以折光性很强的点状或斑块状颗粒沉积于中性粒细胞的胞浆内,在光学显微镜下易被识别,借此可以测定中性粒细胞的杀菌功能。
N-NH2
-C
N=NH
NBT还原反应的结构式如下:
八-+H+
-C
N=N—R
四氮唑基 甲基
【试剂和器材】
NBT(Sigma产品),%NaCl,用超细玻璃滤器过滤;小量分装,冰冻保存。
%沙黄O(safraninO,Fisher产品)染液取1g沙黄O加入100ml蒸馏水和40ml甘油。
。
试剂无菌生理盐水、甲醇等。
器材37r温箱、显微镜、载玻片、盖玻片、湿盒、一次性采血针、酒精棉球、无菌干棉球等。
【步骤和方法】
无菌取人末梢血1滴于盖玻片上。
将盖玻片放入湿盒,置37r温育20min。
用无菌生理盐水仔细洗去血凝块。
取载玻片,滴加1滴培养液,将盖玻片反扣在培养液上。
放入湿盒,置37r温育30min。
取下盖玻片,空气中快速干燥。
用甲醇固定1min,用蒸馏水洗涤。
%沙黄O染液染色5min,水洗,放在载玻片上镜检。
【结果判定】甲阳性细胞体积大,母细胞样,与正常形态PMN不同,它们充满蓝色沉淀物。
正常人甲阳性PMN230%。
【注意事项】
NBT染液应过滤,不要残留颗粒;注意保存,不要被细菌污染。
所有器皿应洁净,避免玻璃表面因素增加NBT的还原作用。
血凝块应用无菌生理盐水轻轻冲洗,以免将中性粒细胞冲掉。
【方法评价】该试验方法简单、快速、便于重复,但易出现假阳性和假阴性结果。
【临床意义】
此试验为慢性肉芽肿病人检测的筛选试验,这些病人无甲阳性细胞,疾病隐性携带者结果小于正常人。此外,细菌感染(尤其是全身感染)者NBT阳性率可升高。
【思考题】
简述NBT还原试验的原理。
?
二、白细胞杀菌功能测定
(Leukocytebacterialkillingassay)
【实验原理】将白细胞与细菌、调理素按一定比例混合、培养;短时间作用之后再加入抗生素以杀死胞外细菌,因抗生素不能进入细胞,故吞入胞内的细菌存活;定时取样将白细胞用蒸馏水溶解,释放出细菌,进行培养、计数生长的菌落即可了解中性粒细胞的杀菌功能。
【主要试剂和器材】
1•青霉素-链霉素液浓度分别为5000U/ml和5000“g/m,l用Hanks液配制。
调理素至少取5个AB血型个体血清,混合后小量分装,置-70°C保存,不要反复冻融。
无菌Hanks液、蒸馏水、生理盐水。
硅油处理过的无菌试管、离心管、吸管。
无菌平皿。
【操作方法】
细菌悬液制备
将金黄色葡萄球菌502A接种于肉汤培养基中,置37C培养过夜。
3000r/min离心10min去上清,并用10ml生理盐水离心洗涤。
用生理盐水调配菌悬液,。
用Hanks液将菌悬液稀释50倍(菌含量约107/m1),备用。
白细胞悬液制备
用含肝素(100U/ml血)的注射器采血10〜20ml,置试管中。
加入1/5体积的6%右旋糖酐(分子量200〜400kDa)生理盐水溶液,混匀后在37C直立放置30〜60min。
取血浆层,室温1500r/min离心5min,去上清。
用hanks液洗涤,配成浓度为107/m1的细胞悬液。
实验操作
混合液制备
取无菌试管,,,,,混匀。细菌对照管中不加白细胞悬液,用Hanks液代替,其它同实验管,混匀。
放37C摇动培养。
细菌对照管于0时、20min、、3h取样培养计数菌落。实验管于20min、、3h取样培养计数菌落;-链霉素液。
从细菌对照管取样培养计数菌落
,加盖,剧烈振摇。
、,加到两个平皿中,并分别标记1:1000、1:100稀释。
分别倒入营养琼脂(预先煮沸融化,再57C水浴平衡),呈8字形移动平皿轻轻混匀。
37C培养48h,计数菌落,在半对数纸上作图(图3-2)。
从实验管取样培养计数菌落
①,再加入Hanks液5ml。
室温1500r/min离心5min,去上清。
用Hanks液洗涤,,并用吸管剧烈上下吹打使细胞溶解。
、,加到两个平皿中,并分别标记1:200、1:20稀释。
按细菌对照操作步骤③、④进行倾倒平板、培养、计数菌落、作图。
【结果判断】
正常人中性粒细胞在培养90min 107|
后,胞内存活的金黄色葡萄球菌的数
降低2102倍(图30-1)。
【注意事项】
,以防止细菌和胞黏附。

【应用与评价】该试验被认为是评价中性粒细能缺陷的最好试验方法,因为与中性
106三
105
细菌对照■
CGD
量应
细菌存活数Log
z(\
104三
103三
正常人
管、
白细
验。
作。
胞功
粒细
胞吞噬过程相关的如黏附、趋化、吞呼吸爆发、脱颗粒等任何阶段缺陷均响中性粒细胞的杀菌活性。但由于该操作麻烦,故只在其它方法不能进行时才应用。
102
02090180
培养时间(min)
图3-2正常人和CGD患者中性粒细胞杀菌曲线
噬、可影方法诊断
此方法也可用于测定血清的调理活性和吞噬率,前者用新鲜人血清标本(20%血清)代替
调理素可进行检测;后者可在混合物温育15〜30min后涂片、染色检查。
【临床意义】
用于诊断慢性肉芽肿病(CGD)、Chediak-Higashi综合征、严重葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症、髓过氧化物酶缺陷症等中性粒细胞杀菌功能缺陷病。CGD的隐性携带者结果介于正常
人和CGD之间。
【思考题】
?
?
三、巨噬细胞吞噬功能测定
(Macrophagephagocytosistest)
【实验原理】巨噬细胞对颗粒性异物有很强的吞噬功能。当鸡红细胞被注入小鼠腹腔时,会被腹腔中的巨噬细胞吞噬。取小鼠腹腔液涂片、染色,在显微镜下可见到鸡红细胞被吞噬的现象。计算吞噬百分率和吞噬指数,可判断巨噬细胞的吞噬功能。
【试剂和器材】
~25g的健康小白鼠。
%鸡红细胞(CRBC)悬液自鸡腋静脉或心脏采血,放Alsever液中保存(鸡血与Alsever液1:5混合),置4°C可有效保存1个月,临用前用生理盐水将CRBC洗3次,按红细胞压积配成1%CRBC悬液。
6%可溶性淀粉肉汤培养基取肉汤培养基100ml,加入可溶性淀粉6g,混匀,置100°C水浴煮沸消毒。
其它试剂瑞氏(Wright)染液、生理盐水等。
器材无菌注射器及针头、剪刀、镊子、解剖盘、载玻片、显微镜等。【步骤和方法】
于试验前3天向小白鼠腹腔注射6%可溶性淀粉肉汤培养基1ml。
于试验当天向小白鼠腹腔注入1%,并轻轻揉腹。
30min后小白鼠颈椎脱臼处死,取腹腔液涂片,自然干燥后瑞氏染色,用油镜观察。【结果判定】
镜下可见巨噬细胞核呈蓝色,被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形,其胞浆呈红色而核被染成蓝色。置油镜下随机观察100个巨噬细胞,计数吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数和吞噬的鸡红细胞总数。
x100%
吞噬率%=吞噬CRBC的巨噬细胞数巫率%_ 100
吞噬指数二100个巨噬细胞吞噬的CRBC总数巫曰— 100
【注意事项】
涂片的薄厚要适当,否则影响计数。
小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。
如小鼠腹腔液过少,可注入适量生理盐水。
剪开小鼠腹腔时应避免出血,否则将影响试验结果。
被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化,时间过短未被吞噬,必须掌握好吞噬作用时间。
【方法评价】小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能体内测定法较为简单、易于操作且重复性较好,淀粉诱导后小鼠腹腔渗出液中含大量巨噬细胞。但不能应用于临床检测。
【临床意义】小鼠腹腔巨噬细胞功能检测可用于研究某些药物的免疫调节机制,也可用于药物的筛选和判断某些理化因素的生物效应。
【思考题】
简述巨噬细胞吞噬功能测定的原理。
试述巨噬细胞吞噬和杀菌机制。