染色体荧光原位杂交技术.pptx

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1、FISH技术简介
FISH技术包括下列几个步骤:
1、探针的准备和标记;
2、探针和染色体的杂交;
3、信号检测;
4、杂交信号与分带染色体的比较。

探针标记时可采用两种基本方式:
(1)直接标记法:将荧光分子直接标记于探针DNA/RNA上,杂交后可直接在荧光显微镜下检测。这种方式快速简捷,由于杂交信号较弱、且不能进一步放大,以前这种方法用得不多,但它有背景少的优点,近来在一些公司的试剂盒中得到应用。
(2)间接标记法:常用的间接法是将一些类似于半抗原(hapten)的标记分子掺入探针分子中。用的较多的试剂有生物素,地谷新(digoxigenin),二硝基苯(dinitrophenyl,DNP),氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene,AAF),汞和磺酸盐(sulfonate)。就掺入方式来说,生物素,地谷新等是以核苷酸衍生物的形式掺入的,可用切口平移法来进行。现在更多的人开始用随机引物法。用这两种方法标记好的探针大小在200一500bp范围内,是用于杂交的最佳大小。另外,也可以在已知顺序的两个引物之间用PCR法来扩增,或从合适的载体上通过RNA转录而来。

染色体原位杂交:。于37摄氏度、50%。对于单拷贝基因的杂交,特别是较长的来自基因组的序列,一般在杂交之前应进行预复性过程,标记的探针与过量的基因组DNA或Cot-1重复序列一起孵育1小时,使探针中非特异的重复序列被封闭。从而抑制该部分探针与染色体之间发生非特异性杂交,上述过程又称为抑制性染色体原位杂交。经预复性之后已标记好的变性探针(200一500bP)再与变性的染色体在含有甲酰胺,盐和醋酸葡聚糖的杂交缓冲液中杂交过夜。接着是柔和的洗涤,以去除未杂交或错配对的探针。

在洗去未杂交和错配对的探针分子之后,载片培养在免疫荧光试剂中,使其在探针杂交的位置上产生荧光信号,偶联了荧光素分子的抗生物素蛋白被用来标记已掺入到探针分子中的生物素、地谷新、二硝基苯、AFF和磺酸盐则可以用相应的标上了荧光素的抗免疫球蛋白来标记。
最常用的荧光素分子有FITC,rhodamine和TexasRed等。

染色体的分带可以在杂交前,也可以在杂交后,高分辨的染色体标本是取得好的带形的基础。常用的分带方法有:G(Giemsa)带、Q(Quinacrine)带、R(Reverse)带,包括色霉素chromomycinA3/偏端霉素distamycinA法;hoechst33258/propidiumiodide[3,8—二氨基—5—[3—(二乙基-甲基氨)丙基]6-苯菲碘]法,DAPI[DAPI:4,6—diamidino,2—phenylindole2HCl]/propidiumiodide法,染色体的分带也可以直接用AluLIHs(LIhomosapiens)或Alu之间的顺序和染色体杂交而得到类似R带的条带,更多的人在努力使杂交信号和分带可以同时在显微镜下看到。
由于杂交和分带同时进行效果不佳,有人采用FL(fractionallength)来测量。以杂交信号相对于某固定位置(如端粒)的长度占该染色体长度的比例来表示。
在不分带的情况下,特定的染色体可以通过着丝粒特异,或端粒特异的探针进行共杂交来确定。复杂的探针族,如从一个染色体特异的DNA文库中得来的克隆,可以用来修饰和确认染色体,称为染色体绘图。