氟苯尼考的高效液相色谱检测方法.docx

该【氟苯尼考的高效液相色谱检测方法 】是由【guoxiachuanyue015】上传分享，文档一共【23】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【氟苯尼考的高效液相色谱检测方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。武汉轻工大学
毕业论文
论文题目鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测方法
DevelopmentofaHPLCfordeterminationofflorfenicolinchickenplasma
姓名:吕阳
学号:110703112
院(系)动物科学与营养工程学院
专业动物生物技术
指导教师刘宇
2015年6月1日
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
22
1
目录
摘要1
Abstract2
第一章绪论3
1氟苯尼考的研究进展3


!未定义书签。
2研究目的与意义错误!未定义书签。
3研究内容6
第二章试验研究错误!未定义书签。
1材料与方法错误!未定义书签。
!未定义书签。
!未定义书签。

2结果与计算8


!未定义书签。
!未定义书签。
3讨论错误!未定义书签。
第三章结论与建议错误!未定义书签。
1结论错误!未定义书签。
2创新点错误!未定义书签。
3有待进一步研究的问题错误!未定义书签。
参考文献错误!未定义书签。
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
2
1
致谢错误!未定义书签。
本文建立了鸡血浆中氟苯尼考含量的高效液相色谱检测方法,〜200pg/m1,线性方程为y=520000x+170000(r=),%〜%,,日内与日间相对标准偏差均小于5%。本法的色谱柱使用Waters04590型Symmetry-C^柱(,5“m),柱温为30°C,流动相使用乙腈:水=27:73(V:V),进样量10pL,,紫外检测波长为230nm。经验证,本方法具有简便快捷、定量准确,线性关系良好,回收率较高等优点,能够为氟苯尼考的药物代谢动力学研究提供定量依据和检测基础。
关键词:氟苯尼考,高效液相色谱,鸡
Abstract
Thispaperestablishedthechickenflorfenicolinplasmaofhighperformanceliquidchromatography(HPLC)method,/ml(r=),thelinearequation:y=12674x+16319,%%,thevaluesofintra-dayrelativestandarddivinationandinter-dayrelativestandarddivinationwerelessthan5%.Waters04590TypeSymmetry-C^column(,5ym)wasusedintheanalysis,amixtureofacetonitrile-water,,passingthroughthecolumnat30°.
Keywords:HighPerformanceLiquidChromatography,Florfenicol,Chicken
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
3
1
1氟苯尼考的研究进展

氟苯尼考(florfenicol)⑴又称作为氟甲砜霉素,因为其拥有广泛的抗菌谱,在体内极易吸收,分布较为广泛,治疗剂量下未发现毒副作用,防治效果显著,对于敏感菌所引发的动物细菌性疾病具有极佳的治疗效果,广泛应用于养殖业中,是兽用药物中目前正在广泛推广使用的一种新型的氯霉素类的广谱抗菌药。现如今,氟苯尼考已经在水生动物、禽类、猪、反刍动物以及其他畜禽的细菌性疾病⑵的预防和治疗中广泛使用,目前我国已经通过了该药的审批。

纯净的氟苯尼考的性状为结晶性粉末,白色或类白色,无臭。在通常情况下,在有机溶剂中溶解度较高,溶解在水中的剂型大多为混悬液。氟苯尼考在二甲基甲酰胺中溶解度极高,溶解于甲醇,溶剂为冰醋酸时略微溶解,水或氯仿时中的溶解度极低⑶。%〜[4]。
市场上出售的氟苯尼考商品名称(国际通用)多数称之为Florocol和Nuflo⑸。氟苯尼考的化学式为C12H14Cl2FNO4S,,化学结构式⑹如图1:
chci2
氯霉素(Chloramphenicol):Ri=NC)2,R2=OH
甲砚霉素(Thiamphenicol):R产SO2CH3,R2=OH
氟苯尼考(Florfenicol):R】=SO2CH3,R2=F
图1氟苯尼考结构式
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
4
1

氟苯尼考是属于氯霉素类的广谱抗菌药,与氯霉素(CHL)和甲砜霉素(THI)具有相同的作用机理和抗菌谱,它可以与细菌有效地特异性结合,能够通过降低相关酶的活性从而使肽链延伸受到抑制作用,进而干扰甚至丧失了细菌合成蛋白质的功能⑺。然而,结构的修饰与改造令氟苯尼考与CHL和THI相比,显著增强了安全性和有效性。在结构上,氟苯尼考用氟原子取代了CHL和THI中丙烷链上第3个碳原子位置上的羟基,从而对菌体蛋白的乙酰化反应产生阻碍和抑制作用,进而使氟苯尼考不受相关酶的影响,避免了药物的灭活。因而,氟苯尼考不容易出现由质粒介导的耐药性,并且对于大量含有耐CHL基因的病原体,氟苯尼考依旧敏感。氟苯尼考对于大多数细菌都具有杀灭或抑制作用,同时对于厌氧的革兰氏阳性菌和阴性螺旋体,以及立克次氏体,阿米巴原虫等都具有较为显著的抗菌作用⑸。

氟苯尼考在机体内见效快,持续时间长。根据研究者的试验得出,肌肉注射氟苯尼考1小时以后,血液中的药物浓度可以达到治疗浓度,1~3小时后便可以达到高峰期的血药浓度。只需一次给药,有效的血药浓度便可以维持48〜72小时以上,并且不会出现骨髓抑制和再生障碍性贫血的危害。氟苯尼考在体内分布广泛,能够透过血脑屏障来抑制和治愈动物细菌性脑膜炎,相比于其他的抗菌药,氟苯尼考可具有极强的治疗效果。在机体内,部分器官的氟苯尼考药物浓度较高,血药浓度可以达到治疗效果,主要经过肝脏、肾脏代谢,少量的药物可以随粪便由体内排出。根据动物的种类和给药方式的不同,氟苯尼考的药物代谢动力学会有略微差异。

由于临床上氟苯尼考的使用方法不当,如今已经开始出现氟苯尼考的耐药菌株,应该即刻引起人们的广泛关注。1996年,Kim等研究人员第一次发现并且命名了一种能够耐氟苯尼考的基因pp-Flo,根据DNA的序列分析显示得出,pp-%的几率与非酶介导的导氟苯尼考耐药基因为同源基因。在此之后,研究者又陆续地克隆出了多种不同的氟苯尼考的耐药基因,主要是从沙门氏菌、大肠杆菌以及葡萄球菌属中得到,包括Flo、Flor、FexA和Cfr等基因。总体来讲,根据目前的研究结果,主要有Flo、Flor、FexA、以及Cfr和pp-Flo[9]这五种可以耐氟苯尼考的基因。

氟苯尼考如今已经广泛投入使用在各种水生动物(包括鱼、虾、蟹、鲍、贝等在内)的养殖业中。氟苯尼考可以显著地预防和治疗各种急性、慢性的细菌性疾病,例如黄尾鱼的假核性巴氏杆菌病及链球菌病、大西洋鮭鱼疖病[9]、黄尾鱼巴氏杆菌感染、鳗迟钝性爱德华氏菌感染、以及鮭杀鮭弧菌性感染[⑹等。
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
6
1
在猪的养殖业中,在预防和治疗猪喘气病、胸膜肺炎与沙门氏菌病,包括大肠杆菌性下痢、萎缩性鼻炎以及猪丹毒、猪肺疫和无乳综合症等在内的疾病中,氟苯尼考具有显著的防治效果。对于猪胸膜肺炎放线杆菌,氟苯尼考的最小抑菌浓度(MIC)〜,。相比较于阿莫西林(AMX)以及恩诺沙星这两种药物,氟苯尼考对猪链球菌病的治愈率[111明显的高于二者。
氟苯尼考同样广泛地用于预防和治疗牛的细菌性疾病⑵,且防治效果是其他同类药物所不能及。氟苯尼考可以用于防治牛呼吸系统疾病[12]、牛肠炎Ml、牛无名热Ml。单独使用氟苯尼考时,可以明显地抑制溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和嗜血杆菌三种引发牛呼吸道疾病的主要病原体,能够显著地治疗牛的呼吸道感染疾病[151。值得一提的是,各成长阶段的肉牛都能够使用氟苯尼考的注射剂。
目前,氟苯尼考在禽类养殖业的细菌性疾病防治中占有着举足轻重的地位。根据研究者的试验证明,按照1:5的比例,药物浓度50pg/mL来配伍甲氧苄啶(TMP)和氟苯尼考两种药物,即每毫升的药液中含有氟苯尼考42微克,甲氧苄啶8微克,可以极佳的治愈鸡的大肠杆菌病[⑹。每12小时以20~40pg/kg的剂量肌肉注射给药或者口服给药氟苯尼考一次,连续使用三天,能够很好的治疗鸡的多杀性巴氏杆菌病,且效果较为明显[17]。使用氟苯尼考可显著地预防和治疗鸭的传染性浆膜炎,试验表明,将氟苯尼考用于同一种群中出现临床症状的病鸭,%;将氟苯尼考用于同一种群中尚未出现临床症状的鸭种(假定健康鸭),%[18]。如果使用氟苯尼考与多西环素(DOX)的复方制剂,效果相当于甚至高于单独配方的氟苯尼考可溶性粉a】。该复方制剂能够有非常效地抑制鸡的大肠杆菌感染且缓解病鸡的临床症状,并可以显著降低鸡由大肠杆菌感染引起的发病和死亡的几率,且在一定程度上,该制剂可以减少成活鸡的体重下降。

目前,用于检测动物性食品中氟苯尼考含量的方法主要使用气象或液相色谱与色谱质谱联用法,其中高效液相色谱法与液相色谱-质谱联用法最为广泛。当然,根据条件、目的、用途的不同,目前也常用其他的氟苯尼考检测方法,其中主要有电位法、分光光度法、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶束电动毛细管色谱Y法^等。
(GC)与液相色谱法(LC)
使用GC与LC法进行氟苯尼考的含量测定时,提取样品中氟苯尼考的药物残留的主要提取液通常使用乙酸乙酯与甲醇、以及乙腈和丙酮等有机溶剂,其中,乙酸乙酯的提取效率最高[⑼。常用的固相萃取柱有C18柱[201、HLB柱[⑼、MCX柱01或Florisil柱[22]等。
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
6
1
在使气象色谱法分析之前,需要进行样品前处理反应-硅烷化和酰化,以此
来生成热稳定性强并且容易挥发的衍生物,通常需要使用氢火焰离子检测器(FID)或者电子捕获检测器(ECD)㈡1来检测衍生化反应完成之后的样品,。
使用液相色谱法检测时,色谱柱通常使用的是c18柱,检测器通常使用二极管阵列检测器(PDA)[19]、紫外检测器(UVD)[201或者荧光检测器(FLD)[21]。相比于其他的分析方法,高效液相色谱法操作简便,定量准确,结果稳定且消耗时间短,但同时该方法具有灵敏度不高,并且无法提供待测物的结构信息的缺点。-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)
气象色谱-质谱联用法与气象色谱法一样,需要进行衍生化过程,但需要避免水分的出现,水的存在会降低衍生化的效率,生成的产物不稳定。因此,使得GC-MS法的前处理过程极为复杂。
与之相比,液相色谱-串联质谱联用法具有灵敏度高、选择性好、定量准确以及简便快捷、抗干扰的优点,是氟苯尼考含量较为理想的检测方法。使用液相色谱-串联质谱联用法分析不同基质的样品时,有时会出现对基质的抑制作用。故而,使用LC-MS/MS检测时,定量方法的需要使用内标法,也可以采用以基质来匹配标准曲线的法方法来,通过此方法可以提高LC-MS/MS分析方法的准确度和精密度[241。然而,液相色谱-串联质谱联用法的仪器并不普遍,且成本较高,无法得到普及。

电位法
电位法要将样本在乙醇中溶解,再加入氢氧化钠溶液进行加热回流,经稀释以后,加入稀硝酸,然后使用银-玻璃电极进行滴定。电位法是电化学分析领域的主要研究方向之一,该方法定量稳定而准确,但由于其消耗时间过长,操作较为繁琐,不适合快速的分析检测。
分光光度法
由于氟苯尼考在紫外光区具有吸收的特性,可以通过浓度与在特定波长处氟苯尼考的光吸收度的之间的关系,来计算和分析动物性食品中残留的氟苯尼考的含量。使用分光光度法检测分析操作简便,消耗时间短,但由于干扰因素比较多,造成分光光度法的准确度较低,并且专属性较差。
c酶联免疫吸附法(ELISA)
酶联免疫吸附法是一种优秀可靠的分析检测方法,该方法的理论基础是应用了抗原与抗体具有可逆性的特异性结合反应,效果明显。近几年来,国内市场已经发行了试剂盒应用于氟苯尼考的含量测定,这些试剂盒的灵敏度较高,。酶联免疫吸附法具有着灵敏度高、特异性强、并且操作简便、耗时较短,定量与结果准确而稳定等特点和优点,可以适用于氟苯尼考含量的大批量的、快速的检测。但值得一提的是,该方法需要进行抗原与抗体的阳性确定。
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
8
1

胶束电动毛细管色谱法是通过在缓冲溶液中加入各种表面活性剂,从而形成带电荷的胶束。胶束电动毛细管色谱法把色谱技术与电泳技术有机结合起来,吸取了两种方法的优点。该方法既克服了毛细管区带电泳法(CZE)难以分离中性离子的不足,又能弥补高效液相色谱法(HPLC)无法同时测定复杂成分中的中极性粒子和非极性粒子的缺陷,能够在较短时间内完成复杂组分的分离测定。
2研究目的与意义
根据目前的研究,关于氟苯尼考含量的检测方法,检测的对象大多为水产动物、猪、牛等,鸡血浆中氟苯尼考含量的检测方法国内未见报道,国外报道大多数采用的是气象色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱联用法
(LC-MS/MS),但是这两种方法对色谱仪器的要求与条件较为严格,检测的成本较高,不利于推广。为此,本文通过改进国外方法,建立鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测方法,可以为开展对氟苯尼考在鸡体内的药物代谢动力学研究提供定量方法,可以为使用氟苯尼考治疗鸡的细菌性疾病提供科学理论依据。
3研究内容
建立鸡血浆的样品前处理方法和鸡血浆中氟苯尼考的HPLC测定方法。
试验研究
1材料与方法

仪器:Waters1525高效液相色谱分析仪(配Waters2475荧光检测器,2497
检测器,717自动进样器)(美国Waters公司);
PHS-3C型精密pH计;
电子分析天平;
氮气吹干仪(上海济成分析仪器有限公司);
武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
8
1
冷冻离心机BiofugeStratos;
TGLT6C型高速离心机(德国Heraus公司);抽滤瓶();滤器();
Jcx-50G超声波清洗机(山东济宁超声电子仪器厂);药品:氟苯尼考标准品,%(Schering-Plough公司)
乙腈,色谱纯;
乙酸乙酯,色谱纯;氢氧化钠,分析纯;磷酸,分析纯;(北京鹏彩精细化工有限公司);

肉鸡,购自三益家禽育种有限公司
分两组进行实验,每组三只
重量:均重2kg


本方法的色谱柱使用Waters04590型Symmetry-C^柱(,5pm),柱温保持30°C,使用230nm作为检测波长,使用乙腈与水混合作为流动相,乙腈:水=27:73(V:V),,进样量设定为10pL。。

以5mg/kg的剂量在鸡的腋下肌肉注射给药,给药后分别在0,2,4,6,12h于翼下静脉采血2-3ml,置于经由1%的肝素钠润洗的离心管中,以2000r/min的转速离心10min之后,吸取上层血浆液置于塑料管中,在-20C下冷冻保存待用。

量取1ml血浆于15ml离心管;
,旋涡混匀;
加4ml乙酸乙酯,6000r/min离心15min,吸取上层置于10ml离心管;
重复上一步,提取并合并;
50C水浴氮气蒸发吹干;
加入流动相1ml,旋涡混匀;
,13000r/min离心20min;
吸取上层清液于2ml棕色进样瓶,进样10卩1进行检测。

武汉轻工大学学士学位论文
武汉轻工大学学士学位论文
9
1