限制酶多种切割方法.doc

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限制酶的多种切割方法
一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性尾端
单酶切
1)同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。这是最简单的一种方法,含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性尾端,这两个黏性尾端间能经过碱基间的配对
而连接,从而形成重组DNA分子。
2)用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些本源不一样的限制酶鉴别核苷酸序次和切割地址都相同,这种酶称为同裂酶(同切酶或异源同工酶)。同裂酶产生相同的切割,形成相同的黏性尾端。
2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶(BamHⅠ与Bst
Ⅰ),此中的差异只在于当鉴别序次中有甲基化的核苷酸时,一种限
制性内切酶可以切割,另一种则不可以。
3)用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些本源不一样、识其余核苷酸序次和切割地址各不相同,但能产生相同的黏性
尾端,这种酶被称为同尾酶。常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ
和Sau3A就是一组同尾酶,它们切割DNA以后都形成由GATC四个核
苷酸构成的黏性尾端。不言而喻,由同尾酶所产生的DNA片段,是能
够经过其黏性尾端之间的碱基互补作用而相互连接起来。
【例1】(2005年天津理综):限制性内切酶Ⅰ的鉴别序列和
切点是—G↓GATCC—,限制性内切酶Ⅱ的鉴别序列和切点是—↓GATC
—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点,在目的基因的双侧各有1个酶Ⅱ的
切点。
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性尾端。
②请画出目的基因双侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性尾端。
③在DNA连接酶的作用下,上述两种不一样限制酶切割后形成的黏
性尾端能否连接?为何?
分析:这两种酶属于同尾酶,能产生相同的黏性尾端,所以可以
连接起来。
③因为二者产生的黏性尾端相同(都是GATC),黏性尾端之间
能发生碱基互补配对而连接。
4)单酶切的长处与弊端。单酶切长处就是操作简单。它的弊端主要有两个:①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自己环化:用单酶切切割后的目的基因和质粒的双侧各有一个黏性末
端,并且是相同的尾端,所以这两个尾端会发生碱基互补配对而使目
的基因和质粒分别发生首尾相连,都形成环状DNA分子,此中质粒又
恢复成没有切割前的样子。②目的基因与质粒的任意连接:因为目的
基因的插入是要有正确的方向才能正确表达,假如载体和目的基因的
酶切是使用同一种限制酶,那么目的基因的插入就有两种可能了。一
种可能是目的基因的最前端恰巧插在启动子毗邻下游,这样可以正确
表达;另一种恰巧相反,目的基因的尾端插在启动子的毗邻下游(也
就是将目的基因翻转180度以后插入进去的),目的基因则没有方法
表达。这样就简单形成两种重组DNA分子,此中一种重组DNA分子是
我们所需要的,这样就加大了挑选工作量。因而可知,将同一种限制
酶切割目的基因与质粒可以获取两种重组质粒,不可以使质粒与目的基
因发生定向连接。
多酶切
(1)用两种或两种以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段
和运载体。较常有的是用同一组两种限制酶去切割含目的基因的DNA
片段和运载体,二者都会产生拥有两种不一样的黏性尾端的DNA片段
(两个尾端分别用A与B表示),而后混杂起来,那么载体分子的A
端与目的基因的A端连接,载体分子的B端与目的基因的B端连接,
这就形成了重组DNA分子。别的,还可以用不一样组限制酶同时去切割
含目的基因的DNA片段和运载体,此时要用同尾酶或同裂酶去切割。
【例2】(2009年福建理综):转基因抗病香蕉的培养过程如
以下图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切
割位点。请回答:
成立含抗病基因的表达载体A时,应采纳限制酶,对进行切割。
分析:题中抗病基因的双侧分别是PstⅠ和EcoRⅠ的酶切位点,
所以只好用这两种酶去切割。目的基因双侧的黏性尾端是P和E,为
了让目的基因与运载体结合,运载体双侧的黏性尾端也只好是P和E,
所以也只好用PstⅠ和EcoRⅠ酶去切割质粒。不可以单独使用SmaⅠ酶
去同时切割目的基因与质粒的原由是SmaⅠ的酶切位点正幸好目的基
因的中间,假如单独用此酶切割会破坏目的基因的结构。所以,答案
是采纳限制酶PstⅠ和EcoRⅠ对含抗病基因的DNA片段与质粒进行切
割。
2)多酶切的优弊端。多酶切的长处是可以战胜单酶切的两大弊端,一是可防范目的基因与质粒的自己环化:多酶切后目的基因与运载体的双侧的黏性尾端不相同,所以不可以发生自己首尾相连成环状
DNA分子。二是可实现目的基因与质粒的定向连接。比方说紧靠启动
子下游的是PstⅠ的酶切位点,而EcoRⅠ位点在后边,目的基因的前
端是PstⅠ位点,尾端是EcoRⅠ位点,酶切以后插进去,就可以保证
目的基因的前端恰巧插到紧靠着启动子的下游,只产生一种重组质
粒,目的基因实现定向插入,这样就可以顺利表达。2010年江苏生
物高考第27题的第4小题就观察了多酶切的长处。多酶切的弊端是
要用多种酶切割,因为每种限制酶的作用的条件不一样,或是说最适
pH和温度的不一样,一般不可以将一组的两种酶放在同一操作环境中使
用,而是要进行两次操作,更换操作液,以保证酶的高效性。所以,
使用多酶切的方法在实质操作中较复杂。
二、平位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成平尾端
(1)用相同或不一样的限制酶切割含目的基因的DNA片段和运载
体。假如限制酶切割方式是平切,产生的尾端是平尾端,则可用相同
或不一样的限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和运载体,因为两个
不一样的平尾端在DNA连接酶的作用下可以任意连接,详尽的原由是
DNA连接酶连接的不过是DNA双螺旋结构外侧的骨架,即磷酸与脱氧
核糖之间的磷酸二酯键和碱基没关。在2008年江苏生物高考第32题
的第5小题中就有观察关于平尾端任意连接的知识点。
(2)平位切割的优弊端。因为两个不一样的平尾端在DNA连接酶
的作用下可以任意连接,这样就不需要含目的基因的DNA片段和运载
体拥有相同的限制酶鉴别序列,减少了对运载体的优选和改造的工作
量。并且关于非互补的黏性尾端,可以采纳绿豆核酸酶等将其单链削
平或补齐,使它变为平尾端,而后进行连接。在实践中,很少用平末
端,因为平尾端的连接效率比较低,只有在找不到适合切成黏性尾端
的酶切位点而有平尾端切口的状况下才使用。
总之,以上几种酶切方法在近几年的生物高考题中都有所表现,
都有各自的优弊端,在解题时要依据题目中的要求进行酶切方法的选
择,要学会灵巧运用知识,这样才能在高考中拿到高分。