徐长卿诱导人肝癌细胞hepg-2凋亡实验研究.pdf

中文摘要观察徐长卿体外诱导人肝癌细胞系一赴蛲觯醪教教中斐で涞姆肿幼饔机制,为徐长卿治疗肝癌寻找实验依据。椒采用细胞药理学方法研究徐长卿细胞凋亡及凋亡相关调控基因等指标的影响。主要观察指标及方法如下:徐长卿对细胞的毒性作用实验:用ヒ鹊鞍酌附獺细胞分散成单个细胞悬液,用完全培养液制成浓度为觯的细胞悬液,按甀/孔接种于孔板,置℃、饱和湿度、培养箱内培养。待细胞贴壁后换含药培养液甀/孔,每个浓度住=斐で渌嵛镌液作系列倍比稀释成以下八个浓度:■、..、.、.疞;将徐长卿醇提物原液作系列倍比稀释成以下七个浓度、、..、、,置℃、饱和湿度、号嘌淠诩绦嘌⑸璨患右┪锏亩照:笕サ羯锨澹嘞赴肕法测药物对细胞毒性。徐长卿对一赴で叩挠跋欤取对数生长期细胞用%胎牛血清的培养液配成细胞数为液,在孔培养板中接种,每孔O赴诤螅尤牒斐で渌嵛锱ǘ任几和疞和徐长卿醇提物稀浓度为疞和疞的维持培养基,同时设正常对照组继续培养。在培养的第、、、欤魅⊙孔,消化细胞后加入台盼兰染液计活细胞数,并与培养时间作图。徐长卿水提物对肝癌细胞周期的影响:处于指数生长期的细胞,胰酶消化后制成均匀细胞悬液,台盼蓝染色计数。当活细胞率大于%,进行实验。①将细胞悬液用完全培养基稀释至痬又钟培养瓶中,每瓶妫%:、饱和湿度条件下培养小时,然后进行处理。②药物组,培养液中加入徐长卿水提物终浓度为疞、疞,同时做正常细胞对照。作用时间为小时,每组俊染色:弃去培养液,细胞用合遍,胰酶消化种樱崆岽荡虺上赴海胄分钟,去上清,将细胞重悬于冷乙醇中,并轻轻吹打,婀潭ǎ潭ㄊ奔浯笥痓时。固定后离心,,钟,去上清,加入痬腞酶崆岽荡颍椅卤芄种樱ハ赴赗分钟再离心,去上清,加入崆岽荡颍椅卤光分钟。检测:样品最后上机进行检测。用软件分析,统计出各时徐长卿提取物对一伟┫赴蛲龅挠跋欤康痬南赴。然后痬腜相细胞的百分比。
检测方法:运用琼脂糖凝胶电泳检测的不规则降解显一条连续的膜状条带,凋亡细胞的蛞蛭狣降解为蚱涠聚体组成的寡核苷酸片段显“梯状”条带。.魇较赴豕鄄煨斐で涮崛∥锒訦伟┫赴蛲龅挠跋欤一赴呐嘌按恚喝《允て诘南赴.%胰酶消化后制成单细胞悬液%台盼蓝染色,=赴航又种培养瓶中,个细胞/瓶,在℃,!⒈ズ褪6忍跫屡嘌疛焙螅尤牒┡嘌R┪组:每瓶培养液屑尤胄斐で渌嵛镏张ǘ任//欢哉兆榧尤氲攘%。加药后于时、时每个时间点各取肯赴屑觳狻凋亡细胞的检测:小心弃掉培养液,ヒ让赶分钟,轻轻吹打细胞成单细胞悬液,痬离一分钟,痬细胞管中,加入煸龋椅孪卤芄夥跤分钟后每管加入,蹦谏匣辛魇较赴终邸M比径哉管飨赴和补偿设置管,即未染色的细胞,单染墓芎偷ト綪墓魇较赴醴治觯翰捎肁型流式细胞仪,し⒐庠础O冉ǘ哉展苌样,通过调整参数蚐,在散射光点图/中清获显示出一个清晰、集中的细胞群体,对细胞群体进行设门,再以门中细胞进行后续荧光信号检测。将对照管阆赴的荧光强度设定为非特异性本底荧光,,使荧光散入图中裸细胞集中分布在左下象限。保持不变分别将单染墓芎偷ト綪墓苌涎髡瞧饔ü獠钩ブ担行光谱重叠校正后即可分析样本。每个样本上获取,鱿赴捎肅功能软件进行分析。徐长卿对一赴鲋车挠跋欤徐长卿水提物在毒性试验中测定所得,对赴囊┪。徐长卿醇提物对细胞的药物半数毒性浓度。,实验结果如表允尽P斐で渌嵛锛按继嵛镌谂ǘ/赴鱿挚张荨⑽酢⑼崖洌坏率分别达%和斐で渌嵛锱ǘ任疞和醇提物浓度为/保迪荻鹊缬鄄霥降解片段:崛。阂┪镒楹驼O赴榈南赴谂嘌螅9娉樘酓。结果判断:正常活细胞曰蜃樘醮挥诩友赘浇邓老赴捎谄銬重悬细胞至悬液至峁可见细胞形态大致正常。徐长卿对细胞生长曲线的影响:对照组细胞在天时,其细胞数分别为...、.,..
、.颍痬P斐で渌嵛锱ǘ任/团ǘ任/攵哉兆橄赴啾龋飨低于正常组,说明徐长卿水提物具有抑制肝癌细胞增殖作用。而徐长卿醇提物在浓度为疞和浓度为疞,其细胞数与对照组细胞相比,差异不大。说明徐长卿醇提物对狦赴挥邢灾种谱饔谩徐长卿对肝癌细胞周期的影响:徐长卿水提物高剂量作用小时后,一赴南赴芷诜⑸飨员浠细胞大部分处于冢枷赴苁ィ哂诙哉兆榈ィ琍.;处于诘南赴甲苁%,低于对照组.%,蛔饔煤螅τ贕的细胞占细胞总数的ィ攵哉兆橄啾让飨越档停哉兆槲%.细胞周期分析显示,说明徐长卿水提液使该细胞生长阻止于/期。而徐长卿低剂量组则与对照组相比,无显著性差异,但仍可见与大剂量相若的作用趋势。用荻鹊缬痉治鯤赴鸇片段降解情况,结果发现徐长卿水提物疞和疞处理赴腄出现明显排列成梯状的分子条带;流式细胞仪分析:直方图上,峰前出现的亚二倍体峰。峰吹蛲鱿赴纬傻牡蛲龇仰峰徐长卿水提物大剂量作用保蛲雎饰.%,、时为.%;徐长卿水提物小剂量作用时,凋亡率为ィ蔽ィ瞻锥哉兆榈蛲龇逦.%,徐长卿水提物及醇提物对体外培养的人肝癌细胞一び幸种谱饔茫宜徐长卿