总RNA纯化试剂盒说明-中文版.docx

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纯化技术
纯化的基础是旋转柱色谱法,用特有的树脂作为分离介质。RNA优先从其他细胞组分(如蛋白质)中分离出来,而不使用苯酚或者氯仿。纯化步骤包括首先用合适的裂解液融解细胞或组织,然后裂解液中加入乙醇后上样到旋转柱中。树脂结合RNA是基于离子的浓度,所以只有RNA结合到柱子上而所有剩余的蛋白和其他的污染物会在流动液中而被除去或者仍在树脂的顶部。然后结合的RNA用试剂盒提供的洗涤液洗涤以除去所有残余的杂质,然后纯化的总RNA用抽提缓冲液洗涤。纯化的RNA是高度完整的,可以用于一系列的下游实验分析。
说明
试剂盒说明书
柱子结合容量
50yg
柱子取大上样体积
600yL
纯化RNA大小
所有大小,包括小RNA(v200nt)
起始材料最大量
动物细胞
3x106个细胞
动物组织
10mg(对于大部分组织*)
血液
100yL
细菌
1x109个细胞
酵母
1x108个细胞
真菌
50mg
植物组织
50mg
完成10次纯化时间
20min
平均收率
HeLa细胞(1x106个细胞)
15yg
(1x109个细胞)
50yg
优点
使用旋转柱提取,步骤快且简单
・提取总RNA,从大的核糖体RNA(rRNA)至1」小(RNAmicroRNA或者miRNA)
不需要苯酚或氯仿作提取液
・从多种种类来源样品中提取高质量的总RNA
•可以提取和检测到的RNA组织样品可以小到单个动物细胞
试剂盒成分
成分
50preps
裂解液
40mL
洗涤溶液
22mL
抽提缓冲液
6mL
微型旋转柱
50
收集管
50
抽提管()
50
产品说明书
1
储存条件和产品稳定性
所有的溶液需在室温密闭保存。所有的试剂在不开封条件下稳定保存1年。
预防措施和警告事项
该试剂盒只为科研目的设计,不可用于人或者临床。要确保有合适的实验服,在操作化学试剂时一次性的手套和护目镜会磨损。需要更多信息,请参考适合的材料安全表(MSDSs)。
所有人和动物组织的问题是要考虑到潜在的感染。当操作全血样品时,所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行。
用户自备试剂和设备
你需要有以下所需材料才可以使用总RNA纯化试剂盒
对于所有材料的实验步骤
•台式离心机
•95-100%乙醇
・作巯基乙醇
对于动物细胞实验步骤
PBS(无RNase)
对于动物组织的实验步骤
液氮
研钵和研杵
・70%乙醇
对于鼻喉抹片样品的实验步骤・无菌,一次性抹片
对于细菌的实验步骤
・含溶菌酶的TE缓冲液
J对于革兰氏阳性细菌,在TE缓冲液中1mg/mL溶菌酶对于革兰氏阴性细菌,在TE缓冲液中3mg/mL溶菌酶
对于酵母的实验步骤
含有溶细胞酶的重悬浮缓冲液

1M山梨糖醇1单位/儿溶细胞酶
对于真菌的实验步骤
液氮
研钵和研杵
70%乙醇
对于植物的实验步骤
液氮
研钵和研杵
70%乙醇
RNA的操作
RNase是降解RNA的稳定性和活性很强的酶。高压灭菌的溶液和玻璃器皿总是不能有效除去这些酶。所以当操作RNA准备工作的第一步就是有一个无RNase的环境。下面这些预防措施是推荐的针对这些酶最好的措施。
・操作RNA的地方需远离微生物实验地方
干净的、一次性的手套在拿放试剂、样品、移液管、一次性离心管等时会损坏。因此建议经常更换手套以避免污染
・需要有RNA专用的溶液、枪尖、实验服、移液管等用具
・%DEPC处理的高压灭菌水或者用分子生物学指定的无RNase水配制
・用商用的除RNase的溶液清理表面
・当使用提纯的RNA样品时,在用于下游实验过程中确保其在冰上放置
流程图
用总RNA纯化试剂盒纯化RNA的实验步骤
用裂解液滚解细胞或组织
加入乙尊
结合到注子上
用洗涤液洗涤三次
II
涡旋或
八用抽提液抽提
RSA
涡旋
实验步骤
所有的离心步骤都用台式离心机完成。不同的步骤需要不同的转速,所以请查看你的离
心机的说明书以保证其能提供合适的转速。所有的理性步骤都在室温进行。准确的rpm转速可以用下面的公式计算:
RPM=/RCF
10^)(0
这里RCF二需要用重力加速度(相当于地心引力,单位是g);r=转子的半径,单位是cm;而RPM=达到所需地心引力时每分钟的转数

实验前须知
.根据起始材料的不同裂解液的制备步骤也不同(步骤1).然而之后的步骤则在所有情况
中都相同(步骤2-6)。
请确保在从起始材料开始就要按照正确的实验步骤制备裂解液。
.所有的离心步骤都在台式离心机上,除有注释的地方,都以14,000xg(~14,000RPM)转速
进行。所有的离心步骤都在室温离心。
.变速离心机可以发挥试剂盒的最大性能。如果没有变速离心机,可以用固定转速的离心机,
然而这样会减少收率。
.实验前保证所有的溶液都在室温放置
.所有提供的酶在使用前都应在各自的管上内标示的温度下保存
.配制洗涤溶液使用液,在提供的装有洗涤液的瓶内加入50mL95%的乙醇(用户自备)。
这样总体积为72mL。瓶子上的标签有一个方框可以用来检查是否已加入乙醇。
.可选:对于大部分的动物细胞组织,尤其是那些已知含较高含量RNase的组织(如胰腺),以及大部分的植物组织和鼻喉抹片样品,强烈建议在裂解液中加入卩-巯基乙醇。而且也建议想要分离用于高灵敏度的下游实验的RNA的用户。每1mL裂解液加入10此卩-巯基乙醇(用户自备)。卩-巯基乙醇有毒性,请在通风橱中操作。否则,使用试剂盒提供的裂解液。
.为提取完整的病毒RNA,如果起始材料是细胞培养物,按照部分1A,如果起始材料是组织,按照部分1B,如果起始材料是血液,按照部分1C,如果起始材料是鼻喉抹片样品,按照1D。对于从无毒的病毒颗粒中提取RNA,按照部分II。操作过程中动作要迅速很重要。

使用前须知
.建议细胞最大的起始用量是3x106个细胞。可以用血球计和显微镜对细胞计数。一般来
说,。
.收集的细胞沉淀块可以再-70°C保存供以后使用,或者在实验中直接使用。在冻存前要
对细胞计数。
.冻存的细胞沉淀块不能超过2星期以保证不破坏RNA的完整性。
:冻存的细胞沉淀块在实验步骤开始前不能融解。在冻存的细胞块中直接加入裂解液(步
骤1A(ii)c)。
1A(i).单层培养的细胞裂解液的制备
吸弃培养基,然后加入一定量的PBS冲洗细胞层。吸弃PBS。
培养皿中直接加入350yL裂解液。
轻拍培养皿裂解细胞,然后缓冲液在培养皿表面旋转晃动5min。
将裂解液转移到离心管内。
裂解液中加入200吐95-100%乙醇(用户自备)。涡旋混匀10秒。进行到步骤2。注意:对于起始细胞量大于106个细胞的样品,建议将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次,以使在上样到柱子前切断基因组DNA。
1A(ii).悬浮培养的和贴壁生长的细胞裂解液的制备
将培养上清转移到无RNase的离心管中(未提供),然后以最大不超过200xg(〜2000RPM)的转速离心10min沉淀细胞。
小心地除去上清。留下少许几微升0L)的培养基避免细胞沉淀被吸出。
细胞沉淀块中加入350^L裂解液。涡旋震荡15秒裂解细胞,在进行下一步之前确保所有的沉淀块被完全溶解。
-100%乙醇(用户自备)。涡旋混匀10秒。进行到步骤2。注意:对于起始细胞量大于106个细胞的样品,建议将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次,以使在上样到柱子前剪断基因组DNA。

使用前须知
.总RNA纯化试剂盒是用于从小量的组织样品中提取RNA的试剂盒(大部分实验中最大量达到10mg)。
.动物组织中RNA在组织获取后,剪碎和匀浆之前是不受保护的。因此重要的是操作的步骤要尽量快,尤其是细胞裂解液制备的步骤。
.新鲜组织或者冻存的组织均可。组织应迅速放入液氮中然后尽快转入70°C冰箱,长期保存。组织在-70°C中可以保持几个月。在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。
.组织应在RNA稳定液中保存,如RNALaTer®可以和提取步骤兼容。在提取步骤之前用镊子将组织小心从储存液中取出,沥干多余的液体。
组织类型不同,组织最大用量也不同,请参考以下的表格1以确定最大的组织用量。如
•果你的组织在表格中没有包括,我们建议初始的用量不超过10mg。

组织
最大起始用量
脑
25mg
心脏
5mg
肾
10mg
肝
10mg
肺
10mg
脾脏
10mg

从动物中分离组织样品
称量组织重量。请请参考以下的表格1以确定不同组织的最大量。对于表格中没有包括的组织样品我们建议初始的量不超过10mg。
将组织转移至有适量液氮的研钵内,液氮应覆盖过组织。用研杵充分充分研磨组织。
使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。
组织样品中加入400yL裂解液后继续研磨直至样品均匀。将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次使之均匀。
用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内(离心管未提供)。
离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。
收集的裂解液中等体积加入70%的乙醇(每100吐裂解液加入100吐乙醇)。漩涡混匀。继续进行步骤2

实验前须知
所有人和动物组织的问题是要考虑到潜在的感染。当操作全血样品时,所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行
・建议血液的最大用量不能超过lOOyL,避免堵柱。
・我们建议试剂盒用于从非凝集的新鲜血液中提取RNA,用EDTA作为抗凝剂。实验过程中操作要迅速。

将lOOyL未凝集的血液样品转移到无RNase的离心管中(未提供)。
血液中加入350yL裂解液。震荡裂解细胞15秒。在进行到下一步之前保证整个混合物都变透明。
裂解液中加入200yL95-100%乙醇(用户自备)。震荡混匀10秒。进行到步骤2。

使用前须知
所有人和动物组织的体液都是有潜在的感染性。当操作这些样品时,所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行
实验过程中操作要迅速。

将600gL裂解液加入到无RNase的离心管中(未提供)。
用无菌,一次性的棉签在鼻或喉等组织内轻轻擦。
用无菌的器具剪掉收集有鼻喉细胞的棉签头,放入到加有裂解液的离心管中。盖上管盖,室温轻轻震荡孵育5min。
用吸管将裂解液上清转移到无RNase的离心管内(未提供)。记录裂解液的体积。收集的裂解液中等体积加入70%乙醇(每100gL裂解液加入100gL乙醇)。漩涡混匀。继续进行步骤2
1E•细菌裂解液的制备
使用前须知
・按照表格2配制含溶菌酶的TE缓冲液。该溶液需用无菌的,无核酸酶的TE缓冲液配制,然后在冰上放置备用。使用者自己提供这些试剂。
在此步骤中建议最多用109个细菌细胞。用分光光度计测量细菌的生长情况。,浓度是1x109cells/mL。
・对于RNA提取,应该在对数生长期收获细菌。
•细菌沉淀块可在-70°C保存以后使用,或者直接使用。
•冻存的细菌菌块在开始操作之前不能融解。将含溶菌酶的TE缓冲液直接加入冻存的细菌菌块中(步骤1Ec)。
1E•细菌细胞裂解液的制备
14,000xg(〜14,000RPM)离心lmin收集细菌。
吸弃上清,然后尽量小心移走剩余的培养基。
用100此含溶菌酶的TE缓冲液漩涡震荡重悬细菌(见表1)。见表1时间室温温育。
加入300吐裂解液,漩涡充分震荡至少10秒。
加入200yL95-100%的乙醇(用户自备)到裂解液中。漩涡充分震荡至少10秒。继续进行步骤2
表2:不同细菌类型的孵育时间
细菌类型
TE缓冲液中溶菌酶浓度
孵育时间
革兰氏阳性细菌
1mg/mL
5min
革兰氏阴性细菌
3mg/mL
10min
1F酵母菌裂解液的制备
使用前须知
.制备一定量的含溶细菌酶的重悬液,考虑到每次需要100yL的溶液。重悬液需含有以
下成分:,10mMEDTA,1M山梨糖醇,1%0疏基乙醇,1单位/yL溶细胞酶。溶液需要用无菌,无RNase试剂制备,然后在冰上放置直至使用。这些试剂需要用户自己提供。
.该实验建议使用的酵母菌细胞不超过107个细胞或者1mL培养液。
.对于提取RNA,需要收取对数生长期的酵母细胞。
.酵母可以可在-70°C保存以后使用,或者直接使用。
.冻存的酵母菌菌块在开始操作之前不能融解。将含溶细胞酶的重悬液直接加入冻存的细
菌菌块中(步骤1Fc)。
1F细胞裂解液的制备
14,000xg(~14,000RPM)离心1min收集酵母菌菌块。
吸弃上清,然后尽量小心移走剩余的培养基。
用100卩L含溶细胞酶的重悬液完全重悬酵母细胞,漩涡震荡重悬。37°C孵育10min。
加入300yL裂解液,漩涡充分震荡至少10秒。
加入200yL95-100%的乙醇(用户自备)到裂解液中。漩涡充分震荡至少10秒。继续进行步骤
2
1G真菌裂解液的制备
使用前须知
.新鲜或者冻存的真菌菌块均可使用。真菌样品应迅速放入液氮中然后尽快转入70°C冰箱,长期保存。真菌样品组织在-70°C中可以保持几个月。在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。
.该实验中建议真菌的用量不超过50mg,以避免堵柱。
1G真菌裂解液的制备
称重决定真菌的量。建议该实验步骤中真菌的用量不能超过50mg
将真菌块转移到有一定量液氮的研钵中,液氮要覆盖过组织。用研杵充分研磨真菌细胞注意:该步骤研磨的真菌可以在70°C保存,以后再进行RNA提取的步骤。
使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。
组织样品中加入600yL裂解液后继续研磨直至样品均匀。
用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内(离心管未提供)。
离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。
收集的裂解液中加入等体积的70%乙醇(用户自备),(每100吐裂解液中加入100吐乙醇)。震荡充分混匀。继续进行步骤2
1H•植物细胞裂解液的制备
使用前须知
.建议植物组织的样品最大量是50mg或者是5x106个植物细胞。
.新鲜或者冻存的植物组织均可使用。植物样品应迅速放入液氮中然后尽快转入70°C冰箱,长期保存。植物样品在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。
.实验操作动作要迅速。
1H•植物细胞裂解液的制备
将小于等于50mg或者5x106的植物样品转移到有一定量液氮的研钵中,液氮要覆盖过组织。用研杵充分研磨真菌细胞。
注意:如果要保存冻存的组织,在将组织转移到液氮之前不能使组织融解。
使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。
植物组织样品中加入600gL裂解液后继续研磨直至样品均匀。
用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内(离心管未提供)。
离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。
收集的裂解液中加入等体积的70%乙醇(用户自备),(每100吐裂解液中加入100吐乙醇)。震荡充分混匀。继续进行步骤2
1I•病毒裂解液的制备
使用前须知
.为提取完整的病毒RNA,如果起始材料是细胞培养物,按照部分1A,如果起始材料是组织,按照部分1B,如果起始材料是血液,按照部分1C,如果起始材料是鼻喉抹片样品,按照1D。
.建议使用最多不超过100gL的病毒颗粒悬液,以避免堵柱。
.实验操作动作要迅速。