无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测.pdf

该【无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测 】是由【智通】上传分享，文档一共【7】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。.
VolNo

FISHERIESSCIENCEJul
:/.‐
DOIjcnki
无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测
崔淼,吴敏,刘茹,黎晶晶,张辉杰,许德麟,张其中
(暨南大学水生生物研究所,热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心,
广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室,广东广州510632)
摘要:为提高罗非鱼链球菌病发前的早期预警,根据海豚链球菌的16基因的部分序列和无
SrRNA
乳链球菌的基因特异性序列,分别合成特异性检测引物,经过对反应体系和反应条件的优化,建立
Sip
检测较低含量的无乳链球菌和海豚链球菌的分子技术。试验结果显示,所建立的双重可扩增出
PCR
870无乳链球菌和614海豚链球菌的特异性片段,而迟钝爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、
bpbp
温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌均为阴性;无乳链球菌和海豚链球菌基因组最低检测量分别
DNA
×10-5/×10-5/μ,×103/×103
ngLngLcfumL
/,远低于其半致死密度107/;对无乳链球菌和海豚链球菌混合感染的模拟临床样品的检
cfumLcfumL
出率为100%。研究结果表明,该分子技术的特异性较强、灵敏度较高、检出率较高,可用于较低含量的
无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,为罗非鱼链球菌的早期预警分子检测提供技术支持。
关键词:罗非鱼;无乳链球菌;海豚链球菌;早期预警;分子检测
中图分类号::文章编号:1003‐1111(2021)04‐0589‐07
SA
罗非鱼(Oreochromis)是世界范围内广泛养殖的菌落、菌体形态上,都很难准确判定病害是由哪
的水产品之一,据统计,2014年中国罗非鱼养殖产一种链球菌引起的[9],这将严重影响到对链球菌病
×106,约达全球罗非鱼养殖总产害及时、有效的处理。
t
量的32%[1]。近年来,罗非鱼链球菌病日益严重,目前罗非鱼链球菌的常规诊断方法有电镜观
给罗非鱼养殖业造成严重的经济损失。研究表明,察、生化反应和药敏试验等[10],但这些方法均很难
罗非鱼链球菌病的主要致病菌是海豚链球菌对感染鱼样本进行早期分子诊断和预警,同时一些
(Streptococcusiniae)和无乳链球菌(‐生理反应现象可能随外界环境的变化而改变,从而
ae)[2]。无乳链球菌是一种人、畜、鱼共患的致病菌,容易导致误判情况的发生[11]。普通每次仅能
PCR
可引起新生儿患脑膜炎、败血症等[3]。海豚链球菌检测1个基因,可能会造成漏检或误检[12];多克隆
至少能够感染27种海洋和淡水鱼类,死亡率高达抗体和单克隆抗体都是需要提前准备的,而且荧光
30%~50%,而且能通过病鱼感染人类,属机会性抗体和的价格高且操作难[13‐14];尽管等温
ELISA
人畜共患病原菌[4]。罗非鱼链球菌病的优势菌群环介导()较方便,但容易出现假阳性现
LAMP
会发生改变,2006—2007年间,海豚链球菌是罗非象[15];荧光定量()技术的操作要求较高,
PCRqPCR
鱼链球菌病的主要病原菌,占总检出率的947.%[5]。而且设备较为昂贵[16]。因此,为达到对罗非鱼链球
2008年至今,罗非鱼链球菌病主要由无乳链球菌引菌的早期预警,需要建立更加快速、高效的早期分
起,而海豚链球菌仍然是罗非鱼的潜在养殖风子预警检测技术。无乳链球菌与海豚链球菌的16
S
险[6]。海豚链球菌和无乳链球菌均能造成罗非鱼基因的同源性高度相似,%以
rRNA
的严重病害,现有的防治方法除抗生素外还包括中上[17],但是可在16基因的变异区设计特异
SrRNA
草药和疫苗等[7‐8]。但仅从外部症状和两种病原菌性引物,对两种菌进行区分和鉴定。表面免疫源性
收稿日期:2019‐09‐05;修回日期:2020‐07‐29.
基金项目:广东省基础与应用基础研究基金资助项目(20191515012112,20191515011791);广东省科技专项资金资助项目(粤
财科教〔2019〕170号);广东省海洋与渔业厅科技A项目(20160105)A;广州市科技计划项目产学研协同创新重大专项
(201604020029);广州市农村科技特派员项目(2A020032)B.
作者简介:崔淼(1979—),男,副研究员,博士;研究方向GZ:水KT产P动物免疫学.‐:***@163..通讯作者:许德麟
(1980—),女,副研究员,博士;研究方向:分子微生物学.‐:******@
Emailxudelinlivecom
590水产科学第40卷
蛋白()属于编码群链球菌的表面蛋白基因类标准株、无乳链球菌标准株、嗜水气单胞菌、迟钝爱
SipB
群[18],在不同种的血清型菌株中均有存在[19]。笔德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞
者选用无乳链球菌的基因和海豚链球菌16菌、溶藻弧菌、大肠杆菌。在无菌条件下接种于脑
SipS
基因的特异性序列,设计引物并对引物组合心浸液琼脂培养基上,在28℃恒温培养24后收
rRNAh
优化,建立了检测较低含量的无乳链球菌和海豚链集菌体,各细菌基因组的提取步骤,参考革兰
DNA
球菌的双重方法,旨在为罗非鱼链球菌的早期氏阴性菌和革兰氏阳性菌的提取方法[20]。
PCRDNA
预警提供一种灵敏、特异的分子检测技术。
PCR
双重引物组合和温度条件的优化为:用
1材料与方法PCR
2分别将16基因引物和基因引
ddHOSrRNASip
/,然后取16上、下游引
molLSrRNA
[(,)、(,)、(,03.
LLLLL
无乳链球菌标准菌株13813、海豚链球μ)],依次命名为1、2、3;再取基因上、下
ATCCLAAASip
菌标准菌株29178为中国水产科学研究院珠游引物[(,)、(,)、(
ATCCLLLL
江水产研究所惠赠。无乳链球菌的分离菌株和海μ,)],依次命名为1、2、3。通过xy
LLBBBAB
豚链球菌的分离菌株来源于罗非鱼病鱼,由本实验(x=1,2,3;y=1,2,3)进行组合(表1)。
室分离、鉴定和保存;嗜水气单胞菌(
Aeromonas表1无乳链球菌和海豚链球菌引物比例试验组合
迟钝爱德华氏菌
hydrophila)、(Edwardsiellatar‐
da)、维氏气单胞菌()、创伤弧菌(
温和气单胞菌溶藻弧菌
vulnificus)、()、试验号因素组合
Term
()、大肠杆菌(Escherichiacoli)等
NumberGroup
菌株均由本实验室分离鉴定和保存AB
,、。11111
ABAB
试验鱼

ABAB
试验鱼为尼罗罗非鱼体质量
(),31313
ABAB
由广东省罗非鱼良种场提供实验室驯
(50±5),。42121
gABAB
养确认正常无异样后可用于试验
14,。52222
dABAB
主要试剂

ABAB
三羟甲基氨基甲烷十二烷基苯磺酸钠无核
、、73131
ABAB
酸酶水缓冲液溶菌酶蛋白酶苯酚氯
、1×、、、/83232
TEKABAB
仿异戊醇无水乙醇乙醇
/、、70%;(25/93333
2+dNTPmmolABAB
)、10×(无)、2(25/
LPCRBufferMgMgClmmol
)、无菌超纯水、聚合酶(5/μ);脑心反应体系为:10×(无2+)
LrTaqDNAULPCRBufferMg
浸液培养基、琼脂粉。μ,2(25/),(25/
LMgClmmolLLdNTPmmol
),聚合酶(5/μ),引
LLrTaqDNAULL
(x=1,2,3;y=1,2,3),模板各
AB
根据中海豚链球菌的16基μ,2补充至25μ。反应条件为:95℃预
GenBankSrRNAlLddHOL
因部分序列,设计引物1(5′‐‐变性5;95℃变性30,52、54、56、58℃退火30
PATACCGCATAmins
‐3′)和2(5′‐‐,72℃延伸30,扩增30个循环;72℃延伸
AGAGTGATTPACCACCTGTCACTss
‐3′),预期扩增片段大小为614;根据无10。
TCTGCTbpmin
乳链球菌特异性基因的序列,设计引物3(5′‐反应完成后,取不同退火温度条件下每个引物
SipP
‐3′)和4组合的扩增产物5μ,与1μ6×
TGAATAAGAAATTGTTTTTAGCGPPCRLLLoading
(5′‐‐3′),预期充分混匀,在恒压120、%的琼脂糖凝
ACTTGTAATCGTTGGTTCTGCCBufferV
扩增片段大小为870,由华大基因有限公司胶下电泳20。如果16和基因两个
bpminSrRNASip
合成。目的条带同时出现,且无其他杂带,其对应的引物
。并以此建立双重
DNA
从-80℃冰箱保存的菌种中,挑取海豚链球菌检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法。
PCR
第4期崔淼等:无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测591
℃的条带清晰,且退火温度为54℃时的双重
PCRPCR
分别取无乳链球菌、海豚链球菌、嗜水气单胞条带比56、58℃的条带特异性高,所以最终选择54
菌、迟钝爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温℃作为最佳的退火温度。
和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌的基因组和利用优化后的反应体系和反应条件,对无乳链
DNA
无乳链球菌和海豚链球菌基因组的混合样球菌和海豚链球菌标准菌株的混合样本进行检测,
DNA
本,每种模板为1μ。根据筛选出的最佳反应条件出现两条特异性条带;用单一引物分别扩增16
LS
进行扩增,然后在恒压120、12.%的琼脂糖和基因,均出现1条特异性条带,且条带
PCRVrRNASip
凝胶下电泳20。位置与预期结果一致(图2)。将特异性条带序列分
min

PCRSrRNASip
含量的测定为:将无乳链球菌基因组序列比对,结果表明,本研究建立的双重
DNABLAST
×10-2、×10-3、
DNA
×10-4、×10-5、×10-6/μ;海豚链
ngL
×10-2、
DNA
×10-3、×10-4、×10-5、×10-6
/μ。根据筛选出的最佳反应条件和反应体系进
ngL
行扩增,以能检测到的2种细菌基因组的最
DNA
大稀释质量浓度,确定双重的灵敏度。
PCRDNA

PCR
取无乳链球菌和海豚链球菌各5株,提取其基
因组,方法同上。以2种菌基因组混合
DNADNA图1双重的引物组合优化结果
样本为模板,根据筛选出的最佳反应条件和反应体PCR

系进行扩增。重复检测3次,;1~℃时,引物组合
PCRMbpDNA
13813和29178的混合样本为1~9的扩增结果;10~℃时,引物组
PCR
ATCCATCCDNA合1~9的扩增结果;19~℃时,引物
模板,作为阳性对照,确定双重方法的可重PCR
PCR组合1~9的扩增结果;28~℃时,引
复性。PCR
物组合1~8的扩增结果.

.2000;1—9.
PCR7MbpDNAmarkerPCRamplificationresultsof
×10/的1—952
L7cfumLprimercombinationsattheannealingtemperatureof
无乳链球菌、×10/的海豚链球菌,采℃;10—18.
cfumLPCRamplificationresultsofprimercombinations
用腹腔注射法同时人工感染尼罗罗非鱼尾1—954℃;19—27.
18,24atannealingtemperatureofPCR
h1—9
后取其肾脏组织。用十二烷基苯磺酸钠法结合溶amplificationresultsofprimercombinationsatannealing
56℃;28—35.
菌酶法[21],提取肾组织内细菌基因组。再用temperatureofPCRamplificationresultsof
DNA1—858℃.
所建立的双重方法进行检测,以确定双重primercombinationsatannealingtemperatureof
PCR
的临床适用性。
PCR
2结果与分析

由图1可见,将16和基因引物的9
SrRNASip
种组合进行扩增后,通过对引物组合进行相同
PCR
反应体系和反应条件下的优化选择,12引物扩
AB
增在52、54、56、58℃时比其他8种引物组合条带图2单一引物和两对引物扩增结果
PCR
更清晰且特异性更高,
;;;
增。即16上、下游引物(10μ/)的体MbpDNASipSrRNA
SrRNAmolL的结果.
积为05.、,基因上、下游引物(10μ/PCR
;1.;;3.
)的体积为04.、。在相同的反应体系下,退MbpDNAmarkerSipgeneSrRNAgenethe
LL.
火温度为54℃时的双重的特异性条带比52resultofduplexPCR
PCR
592水产科学第40卷
方法扩增出的特异性条带,为无乳链球菌16
PCRS
和海豚链球菌基因目的片段。
rRNASip

PCR
异性
由图3可见,无乳链球菌基因组样品扩
DNA
增的条带为870;海豚链球菌基因组扩增
bpDNA
的条带为614;两种菌的基因组混合样品
bpDNA图4无乳链球菌和海豚链球菌双重的
可同时扩增出870和614的目的条带;以嗜PCRDNA
bpbp敏感性扩增结果
水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤

弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌的基因组

为模板进行扩增,均未出现任何条带。;;1~
DNAMbpDNAN
×10-2、×10-3、×10-4、
DNA
×10-5、×10-6/μ和海豚链球菌质量浓度
ngLDNA
×10-2、×10-3、×10-4、×10-5、×
10-6/μ.
ngL
.2000;.;1—5.
MbpDNAmarkerNnegativecontrolthe
×10-2/μ,×10-3/
DNAconcentrationofngLng
μ,×10-4/μ,×10-5/μ,×10-6
LngLngLand
/,
ngLinandtheDNAconcentrationof
×10-2/μ,×10-3/μ,×10-4/μ,×
ngLngLngL
10-5/μ,×10-6/,.
图3无乳链球菌和海豚链球菌双重特异性扩增结果ngLandngLinrespectively
PCR


;;
MbpDNADNA
球菌基因组;
DNADNA
合样品;4~、迟钝爱德华氏菌、维氏气
单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌的基因
组.
DNA
;‐
MbpDNAmarkerthegenomicDNAof
ae;;3.
thegenomicDNAofthemixedgenomic
;4—
DNAofandthegenomicDNAPCR
,,,,
of
temperate,,.
andrespectively

;;1~
PCRMbpDNAN
×106、×105、×104、×103、×
102/×106、×105、
用本研究建立的双重方法,分别扩增不同cfumL
×104、×103、×102/.
质量浓度的无乳链球菌和海豚链球菌基因组cfumL
;.;1—5.
混合样本(图4)。分别扩增不同质量浓度的无乳链MbpDNAmarkerNnegativecontrolthe
×106/,×
bacterialsolutionconcentrationofcfumL
球菌和海豚链球菌的混合菌液(图5)。检测结果表105/,×104/,×103/,
cfumLcfumLcfumLand
明,该体系检测无乳链球菌和海豚链球菌的灵敏度×102/,‐
cfumLinandthebacterialsolutioncon
均较高,×106/,×105/,×
centrationofcfumLcfumL
-5DNA104/,×103/,×102/S.
×10/μ,海豚链球菌基因cfumLcfumLandcfumLin
ngL-5iniae,.
×10/μ,无乳respectively
DNA3ngL
×10/,
3cfumLPCR
×10/,两种菌的重复性
cfu7mL
最低检测密度均低于半致死密度10/,可用各取5株无乳链球菌和海豚链球菌,以2种菌
cfumL
于罗非鱼链球菌的早期预警分子检测。的基因组混合样本为模板,在优化的双重
DNAPCR
第4期崔淼等:无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测593
反应体系下,均能同时扩增出2条特异性条带,与技术,对实现罗非鱼链球菌的早发现、早防御和早
阳性对照的扩增结果相同(图6)。重复性检测3次治疗具有重要的经济意义和社会价值。
的结果完全一致,
复性。本研究建立的分子检测技术为双重,其是
PCR
在普通的基础上改进的,具有灵敏、经济、简便
PCR
的优点。该检测体系通过一个反应,能同时快
PCR
速检测或鉴定两种病原微生物[26],节省了时间、试
剂和费用,可广泛应用于水产病原菌的检测。在双
重反应中,引物的设计要考虑较多的因素[27],
PCR
本研究结合了引物的特异性、扩增效率、引物二聚
体等因素,获得了两对较为理想的引物。其中16
S
引物是根据海豚链球菌异于无乳链球菌的
图6重复性检测结果rRNA
16基因特异性序列设计的,克隆得到的

;1~
MbpDNADNASrRNA
合样本为模板;,可以体现出这两种菌的差异,也可以测序得到
;1—‐
MbpDNAmarkeramixedsampleof目标序列。另一基因引物是在无乳链球菌
;6..SipSip
andDNAastemplateapositivecontrol基因特异性序列上设计而成,基因编码了表面
Sip
,是群链球菌表面源性蛋白的特异
PCRB
取18尾同时人工感染无乳链球菌和海豚链球性基因,因此,利用基因引物可以克隆得到无乳
Sip
菌的罗非鱼肾脏样本,提取组织内的细菌基因组链球菌的特异性片段。这两对引物能分别扩增出
,以其作为模板进行双重反应,能同时扩无乳链球菌和海豚链球菌的特异基因片段,而无重
DNAPCR
增出870和614的特异性条带,阳性检出率叠和其他任何杂带,并且目的片段的大小能够在琼
bpbp
为100%(图7)。脂糖凝胶电泳中明显区分。人工同时感染无乳链
球菌和海豚链球菌,罗非鱼组织样品的阳性检出率
为100%,与细菌分离鉴定的结果相同,由此可知,
该检测方法也具有较高的特异性。

关于罗非鱼链球菌的分子检测技术也有报道,
如通过巢式鉴定出无乳链球菌[28];黎炯等[29]
PCR
利用无乳链球菌的基因和海豚链球菌16
cfbS
基因序列建立的双重,其检测灵敏度分
图7双重对同时人工感染无乳链球菌和海豚rRNA-3PCR
×10/μ和海豚链球菌
链球菌的罗非鱼肾组织检测ngL
30.×10-2/μ。而本研究建立的双重可以

:
DNA
;1~-5
MbpDNA×10/μ,海豚链球菌基因组质量浓度
-L5DNA
×10/μ,检测到的目标菌基因组含量
.2000;1—
MbpDNAmarkerbacterialDNAextracted更低灵敏度更高等[30]根据海豚链球
.,。
fromtilapiakidneyartificiallyinfectedwithandRodkhum

atthesametimelctOSrRNA
立的双重,在目标菌密度为106/的鱼
PCRcfumL
3讨论组织中可以检测到该菌株。而本研究建立的双重
可以检测到无乳链球菌菌液密度为
:×
PC3R3
的重大经济损失,其中罗非鱼影响最大,其链球菌10/,×10/
cfumL7cfu
病的主要病原菌是无乳链球菌和海豚链球菌[22‐25]。,更低于目标菌的半致死密度10/,适用
mLcfumL
因此,研究出快速、高效、灵敏的早期预警分子检测于罗非鱼链球菌的早期预警分子检测。
594水产科学第40卷
[11]李为,余龙江,余俊峰,
4结论碳酸酐酶表达及活性的影响[].微生物学通报,2005,
J
本研究建立的分子检测技术,即根据海豚链球32(5):35‐39.
[12]樊琛,徐旺烨,李丹丹,
菌16基因中有别于无乳链球菌的特异性PCRiss
SrRNA基因的缺陷及改进[].江苏农业科学,2015,43(11):
片段、无乳链球菌基因的特异性序列设计双重J
Sip69‐70.
的引物,实现在一个反应体系中同时鉴别罗非
PCR[13],,,.‐
鱼两种链球菌的目的。该检测技术具有较高的特KlesiusPEvansJShoemakerCetalRapiddetec
Streptococcusiniae
tionandidentificationofusinga
异性、灵敏度、可重复性和稳定性,比常规诊断方法‐
monoclonalantibodybasedindirectfluorescent
更加简便快捷,而且可检测更低含量的无乳链球菌[].,2006,258(1/2/3/
antibodytechniqueJAquaculture
和海豚链球菌,适用于罗非鱼链球菌的早期分子诊4):180‐186.
断和预警,将为罗非鱼链球菌病的预防和诊断提供[14],,,.‐
ShelbyRAShoemakerCAEvansJJetalDevel
技术支持。
opmentofanindirectELISAtodetecthumoralresponse
Streptococcusiniae,Oreo‐
toinfectionofNiletilapia
chromisniloticus[].,
参考文献:JJournalofAppliedAquaculture
2001,11(3):35‐44.
[1],,,.‐
YuanYYuanYMDaiYYetalEconomicprofit[15],,,.‐‐
[].‐KeXHuoHLuMetalDevelopmentofloopme
abilityoftilapiafarminginChinaJAquacultureIn()
,2017,25(3):1253‐
ternationalStreptococcusagalactiae,Oreo‐
[2],,,.‐detectionofintilapia
IsmailMSSitiZASyafiqMRMetalFeedchromisniloticus[].
JJournaloftheWorldAquaculture
basedvaccinationregimeagainststreptococcosisinred,2014,45(5):586‐594.
,Oreochromisniloticus×Oreochromismossa‐Society
tilapia[16],,,.
mbicus[].,2016,12SuYLFengJLiYWetalDevelopmentofa
JBM