SOD的活性测定.doc

SOD的活性测定
SOD活力测定(NBT还原法)
植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化,如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明,植物在逆境胁迫或衰老过程中,细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基(O2-)、羟自由基(OH.)、过氧自由基(ROD)、烷氧自由基(RO)等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸(VC)、VE和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2-、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
超氧自由基(O2.-)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子,化学性质非常活泼,是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时,机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase),简称SOD,能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(
O2.-),生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶(CAT)催化生成H2O和O2,从而减少自由基对有机体的毒害。
一、原理
超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、试剂
(一)试剂
(1) mol/L (Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液:
A液( mol/L NaH2PO4溶液):准确称取NaH2PO4·2H2O (MW=) 于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
B液( mol/L Na2HPO4溶液):准确称取Na2HPO4·12H2O(MW=) 100mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
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4℃冰箱中保存备用。
(2) mol/L
mol/L ,移入1000 mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰箱中保存备用