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如何阅读质粒图谱
第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核 /真核/穿梭质粒)
第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。
1)Ampr水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。
2)tetr可以阻止四环素进入细胞。
3)camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。
4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(卡那霉素衍生物)失活
5)hygr使潮霉素β失活。
第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的
插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于
筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步:再看外源 DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb的外源
DNA
片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。
第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终
止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。
启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
启动子-促进 DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序
的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。
增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基
因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。
核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合
位点,对于原核而言是 AUG(起始密码)和 SD序列。
转录终止顺序(终止子) /翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个
AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。
为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链
上.
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