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什么是包涵体
包涵体即表达外源基因的宿主细胞,可以是原核细胞,如大肠杆菌;也可以是真核细胞,如酵母细胞、哺乳动物细胞等。包涵体是病毒在增殖的过程中,常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构,在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成;少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物,不含病毒粒子。包涵体(inclusion body)
基因工程定义:在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)。
病毒在增殖的过程中,常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构,在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成;少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物,不含病毒粒子。有的位于细胞质中(如天花病毒包涵体),有的位于细胞核中(如疱疹病毒),或细胞质、细胞核中都有(如麻疹病毒)。有的还具有特殊名称,如天花病毒包涵体叫顾氏(Guarnieri)小体,狂犬病毒包涵体叫内基氏(Negri)小体。
特性
一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,-1um,难溶于水,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
形成
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
在基因重组技术得到迅速发展之前,研究者就已经发现,细胞内人工引入反常的蛋白质(这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质),这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质聚集的形态是明显的球形,这些球形的物质全部是蛋白质,并且通过非共价键的作用力形成,必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)或者盐酸胍才能溶解。自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后,人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态。
iou等人发现天然的蛋白质在大肠杆菌中大量表达时,如内酰氨
酶和碱性磷酸酶的过量表达,都形成了包涵体,前者的包涵体在外周质,后者的包涵体存在于细胞质中。其它的宿主细胞中也发现了重组蛋白质过量表达时形成的包涵体或者聚集体,如细菌病毒、哺乳动物细胞中。
包涵体在一些外界压力下也可以形成,如温度,是影响包涵体形成与否的主要因素。有些蛋白质在高温的情况下容易形成包涵体,这是由于这些蛋白质在高温下容易变性而形成聚集体。所以有人认为,当蛋白质具有高的融化温度、高的天然构象稳定性的情况下,包涵体就不容易形成。但是,对一些体内包涵体形成的研究发现,包涵体的形成先于成熟肽链的形成,或者是同时进行的。在研究P22尾刺蛋白质发现,尽管尾刺蛋白质有高的稳定性,结构中主要是片断,融化的温度是88℃,并不受SDS、蛋白质酶和热失活的作用,但是这种蛋白质是为数不多的在细胞内形成包涵体的原核蛋白质模型。有些天然的蛋白质在高温(℃)表达时可以提高25%,但是这些蛋白质不能折叠成天然的状态而形成聚集体。聚集体形成的动力学表明,这些聚集体是从部分折叠的中间体形成的。实际上,这些折叠的中间体或者形成天然的状态,或者形成聚集体,这个过程是温度依赖性的,温度的升高利于聚集体的形成。当蛋白质肽链在高温下表达,合成的肽链足够早地转移到低温下时,这些蛋白质肽链会重新进入折叠的过程。同时,当尾刺蛋白质在允许的温度下表达后,再把细胞转移到高温下,这些蛋白质肽链保持活性,证明了一旦蛋白质被正确的表达并折叠成正确的构象以后,则细胞内的蛋白质的稳定性和溶解性在高温下不再改变。蛋白质在体内折叠的中间体对于温度因子明显敏感。
沙眼衣原体包涵体认为较高的温度可能增加了蛋白质合成的速度、折叠中间体形成聚集体的速度以及疏水相互作用力,表达的蛋白质易于以包涵体的形式存在。
其它的发酵条件同样影响蛋白质包涵体的形成,发酵液中加入蔗糖可以大大降低