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免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤
一、实验原理与意义
免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通
过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新
技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧
光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋
白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
(一)、仪器设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
2. 水浴锅
(二)、试剂
1. PBS缓冲液(―):NaC137mmol/L,KCl ,Na2HPO4 , KH2PO4 . (CB,,1000ml):柠檬酸三钠3g,。
EDTA缓冲液(): EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L , 加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS缓冲液():在800ml水中溶解121gTris碱,, 加水1000ml。
5. 酶消化液:%胰蛋白酶:%CaCl 12()配制。%胃蛋白酶液:。
6. 3%甲醇―H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 风裱剂:(–)等量混合 b 油和TBS(PBS)配制
–,适用于荧光纤维镜标本;-
(三)、操作流程
1、脱蜡和水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:
A 抗原热修复
a 高压热修复在沸水中加入EDTA()().盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色加上,缓慢加压,是玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。 10分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b ()至95℃左右,放入组织芯片加热10-15分钟。 c ()至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5-10分钟, 反复1-2次。适用的抗原: Bcl------cadherin.
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B %%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃,消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原:包括 . -erB-
3、免疫组化染色SP法
(1) 脱蜡、水化
(2)PBS洗2-3次各5分钟
(3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟
(4)PBS洗2-3次各5分钟
(5)抗原修复
(6)PBS洗2-3次各5分钟
(7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体
(8)滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
(9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟
(10)PBS洗3次每次2分钟
(11)滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时
(12)Ⅱ%的 tween-20.
(13)PBS洗3次各5分钟
(14)DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度
(15)PBS或自来水冲洗10分钟
(16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化
(17)自来水冲洗10-15分钟
(18)脱水、透明、封片、镜检。
4、SABC法
(1) 脱蜡、水化
(2)PBS洗