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培养基母液配制
培养基配制通常先根据各组分性质,配制成较浓的母液(母液浓度为培养基浓度的若干倍如50或100倍),贮存在冰箱中备用,以后配制培养基时根据用量量取。由于培养基成分较多,如果每配制一次即进行多次称量(不少成分用量较微),不仅会造成较大的误差,而且会增加工作量,因而配制母液可使培养基配制方便准确。配制大量成分母液通常为原培养基浓度的20、50或100倍,倍数不宜过高。MS培养基母液及培养基配方法参考表2。
大量成分母液经常将CaCl2·2H2O单独配制保存,以免长期贮存发生沉淀。若将全部大量成分配在一起时,为防止在混合时发生沉淀,须在各药品充分溶解后,,氯化钙最后加入,,在1000ml容量瓶中定容,然后移入磨口瓶中,贴上标签,置于普通冰箱(4℃)贮存。
微量元素母液配制时,由于培养基中微量元素用量甚微,~,所以母液浓度宜为原培养基配方中用量的100倍。一般将微量元素分别称量溶解,定容在1000ml容量瓶中后贮存在一个细口瓶中,但也有将KI分别配制,单独贮存在棕色瓶中。配好后,贴上标签,贮存于4℃冰箱。
培养基中的铁盐母液一般单独配制。目前常用的铁盐为硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二纳的螯合物。称取Na2-,FeSO4·,分别溶解(可加热),然后混合定溶于1000ml容量瓶中。转入细口瓶,贴上标签,4℃冰箱中保存。
氨基酸和维生素等有机成分母液可配制时,母液浓度通常为原培养基配方的50倍(或100)。常用氨基酸和维生素为水溶性物质,可用蒸馏水溶解,但叶酸要先用少量稀碱或稀氨水溶解,然后用重蒸馏水定容。配制好后,转入细口瓶,贴上标签,-20℃(或4℃)冰箱中保存。
 
植物生长调节物质如生长素类和细胞分裂素类可以根据需要,灵活设计其浓度,、、、。,称25mgNAA溶于50ml重蒸馏水,或50mg的NAA定溶于100ml重蒸馏水中。IAA要用棕色瓶暗中贮存,以免光照分解。常用植物生长调节物质和维生素特征见表3。生长素为醇溶性物质,配制时,应用少量95%酒精或稀碱溶解,然后用重蒸馏水溶解定容;细胞分裂素应先用少量1NNaOH或HCl溶解,然后用重蒸馏水定容。配制好的母液放置在4℃普通冰箱中备用。这些母液保存时间不宜过长,当出现沉淀、浑浊及霉菌团时,应重新配制。
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椰乳中因含有许多种细胞分裂素物质,如KT类似物(9-β-D-ribofuranosylzeatin)、玉米素及玉米素核糖甙等,有时可与细胞分裂素相互代替。采集到椰子时,应检查其汁液(保证没有变质),煮沸,滤纸过滤掉蛋白,高温高压消毒,贮存在-20℃下备用。有时可直接加入培养基。酵母提取液也一般也现用现配,称量酵母粉后,加热至沸腾30分钟,过滤去渣。
 
四、实验步骤
1、大量元素母液的配制
各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍用天平称取,用蒸馏水分别溶解,按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中,即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶,贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时,每配1L培养基取此液100ml。
表1 MS培养基大量元素母液制备
 
序号
药品名称
培养基浓度(mg/L)
扩大10称量(mg)
1
NH4NO3
1650
16500
2
KNO3
1900
19000
3
CaCl2·2H2O 
440
4400
4
MgSO4·7H2O
370
3700
5
KH2PO4
170
1700
 
注意:
(1)配制大量元素母液时,某些无机成分如Ca2+、SO42-、Mg2+和H2PO4一等在一起可能发生化学反应,产生沉淀物。为避免此现象发生,母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解,药品采用等级较高的分析纯,各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合,混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等离子错开混合,速度宜慢,边搅拌边混合。
(2)CaCl2·2H2O要在最后单独加入,在溶解CaCl2·2H2O时,蒸馏水需加热沸腾,除去水中的CO2,以防沉淀。另外,CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾,操作时要防止其溢出。
2、微量元素母液的配制
MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物(除Fe)组成。微量元素用量较少,特别是 CuSO4·5H2O、 CoCl2·6H2O ,因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2,表3配方,用电光天平称量,其它同大量元素。配制培养基时,每配制1L培养基,取微量Ⅰ10ml,微量Ⅱ。
表2  MS培养基微量Ⅰ的配制
 
序号
化合物名称
培养基浓度(mg/L)
扩大100倍称量(mg)
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1
MnSO4·4H2O

2230
2
ZnSO4·7H2O

860
3
H3BO3

620
4
KI

83
5
Na2MoO4·2H2O

25
 
 
表3  MS培养基微量Ⅱ的配制
 
序号
化合物名称
培养基浓度(mg/L)
扩大10000倍称量(mg)
1
CuSO4·5H2O 

250
2
CoCl2·6H2O  

250
 
注意:
使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上,用完以后,用吸耳球将天平内的脏物清理干净。
3、铁盐母液的配制
铁盐不是都需要单独配成母液,如柠檬酸铁,只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物,必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便,又比较稳定,不易发生沉淀。配制方法同上,直接用蒸馏水加热搅拌溶解,定容至1L。配制培养基时,配制1L取此液10ml。
表4 MS铁盐母液的配制
 
序号
化合物名称
培养基浓度(mg/L)
扩大100倍称量(mg)
1
Na2-EDTA 

3730
2
FeSO4·7H2O 

2780
 
注意:
在配制铁盐时,如果加热搅拌时间过短,会造成FeS04和Na2-EDTA鳌合不彻底,此时若将其冷藏,FeSO4会结晶析出。为避免此现象发生,配制铁盐母液时,FeSO4和Na2-EDTA应分别加热溶解后混合,并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20-30min),,室温放置冷却后,再冷藏。
4、有机母液的配制
MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解,定容至1L,注意称量时用电子分析天平。配制培养基时,每配1L培养基取此液5ml。
注意:
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由于维生素母液营养丰富,因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液,有效浓度降低,并且易给后期培养造成伤害,不宜再用。避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素,并贮存在棕色无菌瓶中,或缩短贮藏时间。
表5  MS培养基有机物质母液的制备
 
序号
化合物名称
培养基浓度(mg/L)
扩大200倍称量(mg)
1
甘氨酸
2
400
2
肌醇
100
20000
3
盐酸硫胺素(VB1)

100
4
盐酸吡哆素(VB6)

100
5
烟酸

100
 
5、激素母液配制
植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。,需要注意的是:
(1)配制生长素类,例如IAA、NAA、-D、6BA,应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解,或者用1mol/L的NaOH溶解,然后用蒸馏水定容到一定的浓度。
(2)细胞分裂素,例如KT,应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解,再用蒸馏水定容。
(3)配制生物素,用稀氨水溶解,然后定容。
注意:
所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中,若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。
植物组织培养的必要条件
录入时间:2011-7-1913:59:05来源:生技网
 
(一)温度:对大多数植物组织20~28℃即可满足生长所需,其中26~27℃最适合。
 
(二)光: 组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。有些植物组织在暗处生长较好,而另一些植物组织在光亮处生长较好,但由愈伤组织分化成器官时,则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成,光是决定三因素。
 
(三)渗透压:渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1~2个大气压可促进植物组织生长,2个大气压以上时,出现生长障碍,6个大气压时植物组织即无法生存。
 
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(四)酸碱度:一般植物组织生长的最适宜pH为5~。在培养过程中pH可发生变化,加进磷酸氢盐或二氢盐,可起稳定作用。
 
(五)通气:悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡,可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。