武汉大学基因工程李立家.doc

武汉大学基因工程李立家
基因工程学:分离基因以及工程基因过程、方法和相应的原理的一门学科。
基因工程就是在分子水平上,用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质,在体外切割,再和载体拼接重组。然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内,使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新形状,并使之稳定地遗传给下代。
现代基因工程学是和基因组学,蛋白质组学和计算机相结合的产物。
基因工程主要包括克隆和表达,其基本过程如下:
(1)外源DNA制备及限制性核酸内切酶切割;
(2)载体DNA制备及相应的限制性核酸内切酶切割;
(3)用DNA连接酶连接外源DNA和载体DNA;
(4)通过转化或转染方法将上述重组DNA转入受体细
胞中;
(5)筛选和鉴定转化细胞;
(6)表达目的基因和应用。
基因工程三大要素:载体,工具酶,受体(细胞)--细菌、植物和动物加上DNA转移手段
基因工程载体:用于承载、克隆、转移目的基因(也叫外源基因,
DNA片段),能自我复制的DNA分子。常用基因工程载体有:细菌质粒;λ噬菌体;柯斯质粒;穿梭质粒;细菌人工染色体;酵母人工染色体;Ti质粒及其衍生载体
载体的要求:A、复制:具有能在受体细胞中复制的复制起点;B、选择性标记:一般情况下,所要扩增的基因不便于选择,所以作为载体要求具有选择标记;C、限制性酶切位点:对于某一种限制性酶,它的切点数要求是单一的。现在已发展了许多具有多种单一的限制性酶识别位点的载体;D、载体的大小:原则上要求载体越小越好;E、外源基因的性状表达:结构基因的表达需要启动子;F、载体的安全性:要求载体不能随便转移。
质粒的改造:A、删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒的分子量,以提高外源DNA片段的装载量。
B、减少限制性酶切点。缺失突变,限制性酶、核酸外切酶核连接酶的共同作用,机械破碎和质粒之间的重组等方法。
C、加入易于识别的选择性标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞。通过质粒之间的重组,可以使质粒带有合适的选择性标记。
D、关于质粒安全性能的改造。灭活质粒在细菌之间转移的mob基因。
常用的生化遗传标记基因:-半乳糖苷酶基因(lacZ 和lacZα:β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性,装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分:α链和β链。前者负责四聚体装配,后者具β-半乳糖苷酶活性;只有当两者都存在时,才会表现出酶活性,该作用称之为α-
互补作用。这两个部分可独立存在,分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因(LacZ和LacZα)均可作为标记基因。
β-半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物,检测直观; b. lacZα编
码5‘-端可容许很大的变化而不影响酶活性;c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大。
(GUS):该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸及其衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外,它的适用范围十分广泛,因为许多生物中没有这种基因。
:荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶,并产生荧光,若在反应中加入CoA,可使灵敏度提高10倍;或由发光细菌(Photobacterium fischeri)产生的荧光素酶,它与FMN-氧化还原酶联用,通过NAD(P)H的变化测定酶活。
(GFP):发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质,该蛋白质可使大肠杆菌菌落发绿色荧光。
质粒载体的分类及用途:A、克隆载体。用于克隆和扩增外源基因,它们或者含有能为氯霉素扩增的松弛型复制子结构,如pBR系列;或者复制子经过人工诱变,解除对质粒拷贝数的负调控作用,使质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。
B、测序载体。这类载体通常高拷贝复制,并含有Polylinker,便于各种DNA片段的克隆与扩增。在Polylinker的两端含有两个不同的引物序列(
T3/T5),使得重组质粒经碱变性后即可进行DNA测序反应,如pUC18/pUC19系列。另一种测序质粒是M13噬菌体DNA与质粒DNA的杂合分子,如M13mp系列,它们在受体细胞中复制后,可以特定的单链DNA形式分泌到细胞外,克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。
C、穿梭载体。这种载体分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因,因此能在两种不同种属的受体细胞种复制并检测,如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。
D、探针载体。这类载体被用来筛选克隆基因的表达调控元件,如启动子