聚合酶链反应-直接测序法检测凝血因子V基因突变.pdf

江西农业学报,:~

聚合酶链反应一直接测序法检测凝血因子基因突变
周丽霞,肖勇,杨耀东
中国热带农业科学院椰子研究所、海南省热带油料作物生物学重点实验室,海南文昌
摘要:凝血因子是凝血过程中一种重要的辅因子,其号外显子位鸟嘌呤核苷酸被腺嘌呤核苷酸
所取代即—,从而导致该基因有一个点突变,突变后的凝血因子对抗凝血系统中一种血浆蛋白质产生抗性,
使血栓发生的风险大大增加。通过设计了两对不同的引物,利用扩增、琼脂糖凝胶电泳和测序法,检测凝血因
子是否发生了点突变即—,从而建立一种简单、快速、准确地检测单基因遗传突变的方法。
关键词:凝血因子;基因突变;;测序
中图分类号:. 文献标志码: 文章编号:———

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血栓性疾病常见于临床患者,尤其是心、脑血管血实验结果的,确保其准确性。该方法简
栓性疾病,已成为人口病死的重要原因。近年来,其发单、快速准确、成本较低,针对不同的单基因突变,设计
病率有增加趋势,严重危害人类健康。以往已知的不同的引物,可成为一种通用的单基因遗传突变检测
发病危险因素包括:老龄、肥胖、饮食不合理等,随着分方法,达到协助临床诊断的目的。
子生物学与临床医学的不断交叉融合,发现其遗传因材料与方法
素也占有重要地位。。凝血因子基因位于染色体
. 样本收集本实验个样本来自于
,全长.,包括个外显子和个内含子,
骨髓库样品,每个样品取外周血~,抗凝处理,
其表达的凝血因子是一种单链糖蛋白。活化后的凝
℃保存。
血因子经过血液中活化蛋白裂解后失活,从而限
. 基因组提取利用天根提取试剂盒
制血凝块的形成。当凝血因子基因号外显子
从外周血细胞中提取,具体方法参考试剂盒说
位鸟嘌呤核苷酸被腺嘌呤核苷酸所取代
明书。
即—,引起凝血因子氨基酸序列位的
精氨酸被谷氨酸置换,导致活化蛋白的. 引物第一对引物:端引物:一—
裂解位点发生突变,使得活化的凝血因子仍保持促一,端弓物:一—
凝血的活性,而对抗凝系统的失活作用耐受性增强,从一;第二对引物:端引物:
而使抗凝作用减弱,凝血作用增强,导致了血栓形成的一一,端弓物:一
风险性大大增加。一。
本文首先设计了两对不同的特异性引物,
凝血因子的突变位点进行扩增和测序,实现了目的片段,其反应体系为上下引物各为.,
收稿日期:——
基金项目:国家自然科学基金。
作者简介:周丽霞一,女,山东聊城人,研究实开发研究。通讯作者:杨耀东。
】周丽成等:聚合酶链反戊一卣接测序法检测凝血闪子基因突变
. ,. ,模板., 结果表日:测序结果的碱基与凝血因子中
酶. . ,使得管反应体积为位点一一致,样品的位均为,术发生
反应参数为模板变性℃、,循环变性基突变, 此同时,用两物进行验证,更确
℃、,第一套和第二套引物的循环退火分别为保了实验结果的准确性.
币【℃各,循环延仲℃、,循环周期后
。
、
. 产物检测:述扩增的片段采
片】.%琼脂糖凝胶电泳检