目标蛋白粗提方法.doc

目标蛋白粗提方法
狭义来讲,提取指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离,由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程,即分离前期被提取物从破碎的细胞中释放出来的过程。如果被提取物程固相或与固体结合,提取时由固相转入液相,常称为固液萃取;如果被提取物已经呈液相存在,提取时由一液相转入转入另一互不相溶的液相,这种方法称为液液萃取。
广义来讲,提取又可称为抽提或萃取,贯穿在整个分离纯化过程中,如核酸制备中用氯仿或苯酚反复抽提除去蛋白质,分离DNA和RNA。
提取的好坏受到多种因素的影响,包括:
1)溶液涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂(如尿素和盐酸胍)和粘稠度、溶液的更换;
2)材料包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理;
3)目的分子目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量;
4)其它因素搅拌、提取时间的长短。
第一节溶剂和溶解度
一. 溶剂
一些常用溶剂按其极性的大小,可依顺序大体排列如下:饱和烃类<全卤代烃类<不饱和烃类<醚类<未全卤代烃类~脂类<酮类<醇类。
还可按形成氢键能力的大小,分为五类:
1)能形成两个以上氢键的溶剂分子如水,其两个氢原子和一个氧原子都可以形成氢键;
2)能形成两个氢键的溶剂分子既是氢键的供体又是氢键的受体,例如脂肪族的醇类;
3)只作质子受体的溶剂分子如脂肪族的醚类;
4)只作质子供体的溶剂分子如氯仿;
5)不能形成氢键的烃类如四氯化碳。
1)和2)两类溶剂宜用于极性化合物的提取,3)和4)两类溶剂宜用于对溶液中弱极性或非极性化合物的提取。

溶解度用于分离提纯有两个主要目的:1)选择一个对制备物溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂,使制备物从组分中有选择地被孤立出来;2)或选择一个对制备物溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂,使制备物从组分中沉淀或结晶出来。
1. 物质溶解性质的一般规律可归纳为如下几点:
1)极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性溶剂中;
2)碱性物质易溶于酸性物质中,酸性物质易溶于碱性物质中;
3)在极性溶液中,溶剂介电常数的减少伴随溶质溶解度的降低。
总之,符合"相似相溶"原则。
2. 影响物质溶解度的几个主要因素:
1)离子强度
,如DNA-蛋白,在高离子强度下溶解度增加。
,如绝大多数球蛋白和酶,在低离子强度下溶解性增加,称为盐溶;而在高离子强度下溶解度下降,直至出现沉淀,称为盐析。
,而且在低介电常数溶剂,如乙醇,也同样发生。故而稀盐液常用于大多数生化物质的提取。
2)PH 值
,在等电点时易相互聚集,溶解度最低;而在远离等电点两侧的PH值时,溶解度增大。
,在PH值很低时酸性物质呈现非解离分子状态,而碱性物质呈现阳离子状态;反之,酸性物质呈现阴离子状态,而碱性物质呈现非解离分子状态。离子状态的物质,不论是阳离子或阴离子都易溶于水,非离子的分子状态则易溶于有机溶剂。
、酶、核酸等生物大分子来说,应避免过酸或过碱,一般控制在PH6-8范围。如单纯从溶解度考虑,等电点在酸性范围的蛋白或酶,可选用偏酸性溶液提取;等电点在碱性范围内,则选用偏酸性溶液提取,酸性条件还可解离目的蛋白与其它组分形成的离子键,并有利于细胞的溶解。
3)温度
,减少溶液的粘度,有利于提取的进行。对于一些植物成分或某些小分子生化物质,提取温度常在50-70度。
,但所得提取液含杂质较多,不如冷提取法。对绝大部分生物大分子而言,提取温度一般控制在0~10度之间,以防止生物大分子的变性。
4)去垢剂
去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质,一般具有乳化、分散、和增溶作用,可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型,中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。
,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如PEG200;多元醇类表面活性剂,如山梨醇、司盘类和吐温类;聚氧乙烯脂肪醇醚,如苄泽类、平平加类;聚氧乙烯烷基苯酚醚,如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去;也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢剂。
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